俞清江 張浩 王清清

肝癌是導(dǎo)致惡性腫瘤相關(guān)死亡的第三大病因［1］。多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已是中晚期，或失去手術(shù)機(jī)會(huì)，即使行根治性手術(shù)，5年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高達(dá)60%～70%，預(yù)后極差［2-4］。索拉菲尼（Sorafenib）是晚期肝癌的一線推薦用藥［5］，但長期使用可引起患者耐藥，其療效有所限制。研究表明，大黃素（Emodin）可作為輔助用藥增強(qiáng)化療藥物的敏感性［6］，其廣泛存在于大黃、虎杖、何首烏等中藥材中，是一種天然蒽醌衍生物，目前已被用于胰腺癌、胃癌、直腸癌等多種惡性腫瘤的臨床治療［7-8］。本研究初步探討大黃素增強(qiáng)肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的藥物敏感性的作用機(jī)制，為臨床上治療晚期肝癌索拉菲尼耐藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人肝癌Huh7細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞所；胎牛血清（FBS），購自美國Gibco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基，購自美國Hyclone公司；大黃素（Emodin）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；一抗兔抗人Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、Caspase3、GAPDH均購自美國Abcam公司；RIPA裂解液、胰酶細(xì)胞消化液、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Annexin-FITC凋亡試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 研究方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：本課題組前期已用濃度遞增誘導(dǎo)法成功誘導(dǎo)人肝癌Huh7SR細(xì)胞［9］，使用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Huh7SR細(xì)胞，取生長狀態(tài)良好、對(duì)數(shù)生長期的Huh7SR細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，制成濃度5×104/L的細(xì)胞懸液，之后接種于96孔板上，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，丟棄培養(yǎng)液，加入不同濃度（10 μM、20 μM、30 μM、40 μM、50 μM）大黃素的培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，不含Emo的培養(yǎng)基作為對(duì)照組，只含培養(yǎng)基無細(xì)胞為空白組，各組干預(yù)48 h。（2）CCK8檢測(cè)大黃素對(duì)人肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞活性的影響：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組培養(yǎng)基上每孔加入CCK8溶液10 μL，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，采用酶標(biāo)儀（波長450 nm）檢測(cè)各孔的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）/（對(duì)照組A值-空白組A值）×100%。（3）分組：根據(jù)處理因素的不同進(jìn)行分組，對(duì)照（Con）組人肝癌Huh7SR細(xì)胞不作處理，索拉菲尼（Sora）組加入2 μM索拉菲尼，大黃素（Emo）組加入25 μM大黃素、聯(lián)合（Com）組加入2 μM索拉菲尼和25 μM大黃素，經(jīng)干預(yù)處理48 h后，用預(yù)冷的PBS清洗三次。（4）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大黃素對(duì)Huh7SR凋亡的影響：將經(jīng)胰酶消化、離心后收集的Huh7SR細(xì)胞重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中，之后加入5 μL Annexin V-FITC溶液輕輕混勻，再加入10 μL 碘化丙啶（PI）染色混勻，室溫避光下繼續(xù)染色30 min，1 h內(nèi)完成檢測(cè)，重復(fù)3次取平均值。（5）蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)相關(guān)蛋白：Con組、Sora組、Emo組和Com組均加入細(xì)胞蛋白裂解液（RIPA裂解液：PMSF=100∶1），置于冰山裂解30 min，提取各組細(xì)胞總蛋白，在4 ℃環(huán)境中、以12,000 r/min離心15 min，留取上清液；使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度；沸水煮沸10 min使蛋白變性后儲(chǔ)存?zhèn)溆?；各組取約30 μg蛋白置于10%SDSPAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至NC膜上，加入5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h；各組分別加入相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜，PBST漂洗3次，辣根過氧物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1.5 h，PBST再次漂洗3次后加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，化學(xué)發(fā)光儀器采集圖片，Image J軟件分析灰度值并計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度大黃素對(duì)人肝癌Huh7SR細(xì)胞增殖活力的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著大黃素濃度的增加，人肝癌Huh7SR細(xì)胞的增殖活力逐漸下降，呈現(xiàn)濃度梯度關(guān)系。見圖1。

圖1 大黃素干預(yù)后人肝癌Huh7SR細(xì)胞的生存率變化

2.2 大黃素對(duì)肝癌Huh7SR細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Com組凋亡率高于Con組、Sora組和Emo組，提示大黃素能夠促進(jìn)Sora對(duì)肝癌Huh7SR細(xì)胞發(fā)生凋亡。見圖2。

圖2 四組肝癌Huh7SR細(xì)胞的凋亡率比較

2.3 大黃素對(duì)人肝癌Huh7SR細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Com組的促凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase3表達(dá)顯著高于Con組、Sora組和Emo組，抑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)顯著低于Con組、Sora組和Emo組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖3、表1。

圖3 四組人肝癌Huh7SR細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化

表1 四組人肝癌Huh7SR細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

2.4 大黃素對(duì)人肝癌Huh7SR細(xì)胞PI3k/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Com組的p-Akt蛋白表達(dá)顯著低于Con組、Sora組和Emo組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Akt蛋白表達(dá)四組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖4、表2。

表2 四組人肝癌Huh7SR細(xì)胞PI3k/Akt信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

圖4 四組人肝癌Huh7SR細(xì)胞PI3k/Akt信號(hào)蛋白的表達(dá)變化

3 討論

大黃素具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗菌、抗過敏、抗骨質(zhì)疏松、抗糖尿病、免疫抑制、神經(jīng)保護(hù)和護(hù)肝等藥理作用［10］，與多種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長［11-12］。目前，關(guān)于大黃素聯(lián)合小劑量索拉菲尼對(duì)肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)的研究甚少，而分子水平的調(diào)控機(jī)制尚不明確。

PI3k/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，通過調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、耐藥，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肝癌索拉菲尼耐藥與PI3k/Akt信號(hào)通路激活密切相關(guān)，LY294002呈時(shí)間和濃度依賴性，通過抑制PI3k/Akt信號(hào)通路可以抑制人肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞的增殖［9］。由于PI3k/Akt信號(hào)通路參與大黃素聯(lián)合低濃度索拉菲尼誘導(dǎo)人肝癌Huh7SR細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究甚少，本研究將人肝癌Huh7SR細(xì)胞根據(jù)處理藥物的不同分為Con組、Emo組、Sora組和Com組，探討四組PI3k/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)差異。Western blot結(jié)果顯示，Com組的p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著下降，促凋亡蛋白Caspase3、Bax顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著下降。石雪萍等［13］研究提出，PI3k/Akt 信號(hào)通路通過使Akt激活為p-Akt，調(diào)節(jié)其下游的凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Bax 和Bcl-2等，調(diào)控細(xì)胞增殖以及凋亡。本課題組研究指出，大黃素聯(lián)合低濃度索拉菲尼可能通過抑制PI3k/Akt信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌索拉菲尼細(xì)胞的凋亡。

綜上，大黃素聯(lián)合低濃度索拉菲尼抑制肝癌索拉菲尼耐藥細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與PI3k/Akt信號(hào)通路抑制有關(guān)。因本研究未行相對(duì)應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)，故尚有一定局限性。