葉蘭 凌晨

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率占所有惡性腫瘤的9%～10%，惡性程度與腫瘤轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)程中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，癌細(xì)胞表型發(fā)生頻繁的暫時(shí)性、異質(zhì)性改變，表觀遺傳調(diào)控可部分解釋癌細(xì)胞表型靈活轉(zhuǎn)變的特性，其中microRNAs（miRNAs）的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制起著重要作用［1-2］。miR-30a可通過靶向ZEB2［3］和SLUG［4］抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化以及EMT進(jìn)程。超聲（US）成像技術(shù)是一種實(shí)時(shí)成像技術(shù)，造影劑微泡優(yōu)先分布于腫瘤中豐富的微血管，從而進(jìn)行腫瘤顯影［5］。近年來，超聲靶向微泡破壞（UTMD）作為藥物和基因的遞載系統(tǒng)，體現(xiàn)出巨大的潛力，引起眾多研究者的重視。筆者擬利用UTMD技術(shù)在體外研究miR-30a遞載進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞后對(duì)癌細(xì)胞EMT進(jìn)程的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含15%胎牛血清的L-15培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 SonoVue購(gòu)于博萊科公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Bcl-2抗體、Ki-67抗體、cl-caspase-3抗體、Vimentin抗體、N-cadherin抗體、Slug抗體、GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒載體由南京金斯瑞生物科技公司構(gòu)建，流式細(xì)胞分析儀購(gòu)自美國(guó)BD Bioscience公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR為瑞士Roche公司生產(chǎn)，Envision分析儀由美國(guó)PerkinElmer公司生產(chǎn)。

1.3 微泡制備和UTMD轉(zhuǎn)染 SonoVue瓶?jī)?nèi)注射5 mL無菌生理鹽水，振蕩至全部分散。6孔板培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，按照次日達(dá)到70%接種密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)后，用SonoVue進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為4組，每組3孔細(xì)胞。Cells組：無處理；Cells+US+miR-30a組：細(xì)胞中加入50 nM miR-30a，均勻分散后，以1 MHz頻率、1 W/cm2輻照功率超聲30 sec；Cells+MB+miR-30a組：細(xì)胞中加入等量 miR-30a，加入20%原始濃度SonoVue；Cells+UTMD+miR-30a組：細(xì)胞中加入等量miR-30a和SonoVue，以1 MHz頻率、1 W/cm2輻照功率超聲30 sec。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 采用SYBR Green熒光定量PCR法檢測(cè)miR-30a和Slug的基因含量，嚴(yán)格按照Invitrogen說明書進(jìn)行操作，Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，對(duì)各基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，引物由蘇州瑞贏生物公司合成。miR-30a引物 上 游：5'-GAAGGUCAGCUCCUACAAAUGU-3'，下游：5'-GAAGGUCAGCUCCUACAAAUGU-3'， 以U6為內(nèi)參，上游：5'-GGAACGAGAAAGATTAGC-3'，下游：5'-TTGGAATTCACGAAATTCCG-3'。Slug引 物上 游：5'-TCCTGGTCAAGAAGCATT-3'，下 游：5'- GAGGAGGTGTCAGATGGA-3'，以ACTB為內(nèi)參，上游： 5'-ACTCGTCATACTCCTGCT-3'，下 游：5'-GAA ACTACCTTCAACTCC -3'。采用2-ΔΔt法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)內(nèi)參基因的相對(duì)倍數(shù)，各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 各組加藥處理48 h后，采用胰蛋白酶收集懸浮細(xì)胞，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分比，計(jì)算早期、晚期凋亡率之和，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 目的蛋白的Western Blot檢測(cè) 采用胰蛋白酶收集細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解液冰上裂解后，再經(jīng)BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。每組取30 μg蛋白經(jīng)變性和loading后，上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，再經(jīng)PVDF轉(zhuǎn)膜蛋白印跡。用5%脫脂奶粉封閉后，再經(jīng)一抗孵育過夜（4 ℃），再經(jīng)二抗室溫孵育1 h，加ECL顯影液顯色，再由成像分析儀測(cè)量各條帶光密度，計(jì)算各條帶相對(duì)內(nèi)參蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 根據(jù)miR-30a和Slug 3'-UTR結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)wt Slug 3'-UTR和mut Slug 3'-UTR，克隆至熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒載體psiCHECK2上，然后將其和miR-30a mimic、miR-NC共同轉(zhuǎn)染到MDAMB-231細(xì)胞中，按照l(shuí)ipofectamin3000試劑盒說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染24 h后，檢測(cè)海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書操作，計(jì)算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性值的比值，作為miR-30a同Slug的結(jié)合力。

1.8 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 采用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，調(diào)整至105個(gè)/孔，每個(gè)小室的上室（含基質(zhì)膠）內(nèi)加入100 μL細(xì)胞，下室內(nèi)加入700 μL完全培養(yǎng)液，過夜培養(yǎng)后用棉簽拭去上室上表面細(xì)胞，下表面經(jīng)甲醇固定、結(jié)晶紫染色后封片，顯微鏡下計(jì)數(shù)下表面附著的細(xì)胞，并計(jì)算相對(duì)侵襲力。

2 結(jié)果

2.1 UTMD轉(zhuǎn)染效率鑒定 采用qRT-PCR技術(shù)鑒定各組miR-30a的表達(dá)水平，結(jié)果顯示Cells+UTMD+miR-30a組的miR-30a表達(dá)水平明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而Cells組、Cells+US+miR-30a組、Cells+MB+miR-30a組之間miR-30a水平無統(tǒng)計(jì)差異（P>0.05）。見圖1。

圖1 4組MCF-7細(xì)胞中miR-30a的表達(dá)水平

2.2 UTMD遞送的miR-30a促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，Cells組、Cells+US+miR-30a組、Cells+MB+miR-30a組、Cells+UTMD+miR-30a組 的細(xì) 胞 凋亡率分別為（3.2±1.4）%、（4.8±2.1）%、（3.5±1.1）%、（20.2±3.2）%，Cells+UTMD+miR-30a組的細(xì)胞凋亡率顯著高于其余各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其余三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見圖2A。進(jìn)一步檢測(cè)各組的凋亡相關(guān)和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)，可見癌基因Bcl-2和增殖相關(guān)基因Ki-67的蛋白表達(dá)水平在Cells+UTMD+miR-30a組中明顯降低，凋亡執(zhí)行者cl-caspase-3的蛋白表達(dá)水平在Cells+UTMD+miR-30a組中明顯增加，與其余三組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而3個(gè)蛋白的表達(dá)水平在其余三組中比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見圖2B。

圖2 4組MCF-7細(xì)胞凋亡水平和凋亡/增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3 miR-30直接靶向結(jié)合Slug 首先采用miRanda、miRWalk和TargetScan預(yù)測(cè)miR-30a和Slug的靶向結(jié)合位點(diǎn)，Slug 3'-UTR包含兩處進(jìn)化保守的結(jié)構(gòu)域，同miR-30a具有互補(bǔ)性，然后對(duì)Slug 3'-UTR的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，見圖3A，通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-30a mimic和Slug-wt的細(xì)胞的熒光素酶活性最低，同其他轉(zhuǎn)染組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖3B。進(jìn)一步用UTMD遞送miR-30a，并檢測(cè)細(xì)胞中Slug的基因表達(dá)水平，可見同Cells組、Cells+US+miR-30a組、Cells+MB+miR-30a組相比，Cells+UTMD+miR-30a組的Slug基因表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖3C。

圖3 miR-30a同Slug 3'-UTR的靶向關(guān)系檢測(cè)

2.4 miR-30抑制細(xì)胞侵襲和EMT 與Cells組相比，Cells+UTMD+miR-30a組的細(xì)胞侵襲力顯著降低（P<0.05），而Cells+US+miR-30a組、Cells+MB+miR-30a組無顯著變化（P>0.05），見圖4A。進(jìn)一步對(duì)EMT進(jìn)程標(biāo)志蛋白Vimentin和N-cadherin的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，可見Cells+UTMD+miR-30a組中，Vimentin和N-cadherin的蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而其余3組比較差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），同時(shí)，Cells+UTMD+miR-30a組的Slug蛋白表達(dá)水平也顯著降低（P<0.05）。

圖4 4組MCF-7細(xì)胞侵襲能力和EMT能力檢測(cè)

3 討論

乳腺癌的主要治療方式包括手術(shù)、放化療、靶向治療和內(nèi)分泌治療等，腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致復(fù)發(fā)、治療失敗的主要原因，25%～50%的乳腺癌患者最終會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，從而增加死亡風(fēng)險(xiǎn)［6］，故而乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制研究是研發(fā)治療藥物的基礎(chǔ)。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，基因治療有可能成為治療乳腺癌的有效方法之一，但體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的方法具有一定局限性，病毒雖然轉(zhuǎn)染效率高，但容易發(fā)生脫靶反應(yīng)，有著安全性的疑慮；而質(zhì)粒的分子量巨大，會(huì)造成有效劑量低、靶點(diǎn)效率不高。研究證實(shí)，miRNA可能對(duì)乳腺癌惡化和轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)、診斷、治療及患者預(yù)后具有一定指導(dǎo)價(jià)值，有效劑量、靶向性等方面均具有顯著優(yōu)勢(shì)，但受限于遞送方法的影響，易被體內(nèi)廣泛分布的RNA酶水解。

本研究通過觀察超聲靶向微泡破壞（UTMD）技術(shù)遞送miRNA至體外人乳腺癌細(xì)胞的效果，探討miR-30a抑制乳腺癌細(xì)胞生存、侵襲的能力及其作用機(jī)制。結(jié)果顯示，單獨(dú)超聲或單獨(dú)微泡處理，并不能將miR-30a轉(zhuǎn)染進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞，但超聲和微泡聯(lián)合使用時(shí)，miR-30a可被轉(zhuǎn)染進(jìn)入癌細(xì)胞，且其在細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著提高，說明UTMD技術(shù)可以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)染效率［7］。miR-30a表達(dá)水平的提高對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物功能產(chǎn)生一系列影響，Cells+UTMD+miR-30a組乳腺癌細(xì)胞凋亡水平上調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白cl-caspase-3水平降低，癌基因Bcl-2蛋白和增殖相關(guān)蛋白Ki-67表達(dá)降低。研究證實(shí)，經(jīng)UTMD遞送后，癌細(xì)胞內(nèi)上調(diào)的miR-30a對(duì)乳腺癌細(xì)胞下游凋亡和增殖通路具有一定的影響。一項(xiàng)慢性髓系白血病細(xì)胞株的研究顯示，miR-30a高表達(dá)可促進(jìn)K562細(xì)胞的凋亡［8］。綜前所述，miR-30a可能具有促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用。本研究通過軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-30a可能同Slug 3'-UTR結(jié)合，經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-30a直接結(jié)合于Slug 3'-UTR，并且UTMD遞送的miR-30a造成Slug基因表達(dá)和蛋白表達(dá)降低，證實(shí)Slug是miR-30a的靶點(diǎn)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，UTMD遞送的miR-30a減少了MDA-MB-231的侵襲能力。進(jìn)一步檢測(cè)EMT標(biāo)志蛋白證實(shí)，Vimentin和N-cadherin的蛋白表達(dá)水平明顯降低。在EMT進(jìn)程中，癌細(xì)胞逐漸丟失上皮表型，缺乏細(xì)胞-細(xì)胞間的粘附性，增強(qiáng)間充質(zhì)特性，表現(xiàn)為更強(qiáng)的游離性，是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。主要的EMT標(biāo)志物包括上皮標(biāo)記物（如E-cadherin）以及間充質(zhì)標(biāo)志物（如Vimentin、N-cadherin）［9］。Snail的過度表達(dá)是EMT發(fā)生的先決條件，而Slug屬于Snail家族，在腫瘤進(jìn)展過程中亦會(huì)觸發(fā)EMT［10-11］。Slug抑制后可增加緊密連接蛋白CLDN表達(dá)，減少癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移性，發(fā)揮調(diào)節(jié)乳腺癌EMT的作用［12］。Slug還可以通過轉(zhuǎn)錄作用激活三葉蟲FSCN基因表達(dá)，而FSCN在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮維持絲狀偽足的作用，推測(cè)miR-30a抑制的Slug下調(diào)了MDA-MB-231細(xì)胞絲狀偽足的組裝，造成Vimentin和N-cadherin水平降低［13］。本研究結(jié)果證實(shí)，UTMD有效的遞送miR-30a進(jìn)入MDA-MB-231細(xì)胞，并下調(diào)了癌細(xì)胞的EMT水平和細(xì)胞侵襲能力。

綜上，UTMD是一種有效的miRNA遞送方法，miR-30a對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT具有靶向抑制作用，UTMD可以通過遞送抑癌基因成為一種基因治療方法。