尹 秀，陳 蕊，常 萌，孫自立，喬旭輝，祿亞洲**

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院西南大學(xué)藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心，西藏 林芝 860000）

雞腿菇（Copriuns comatus） 隸屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目 （A－garicales） 鬼傘科 （Psathyrellaceae） 鬼傘屬 （Coprinus），學(xué)名毛頭鬼傘，其形似雞腿，味近雞絲，因而又名雞腿蘑[1-2]。雞腿菇菌柄與菌蓋均呈圓柱狀，菌蓋包被狀，子實(shí)體較大[3]，肉質(zhì)細(xì)嫩爽滑，鮮美可口，營養(yǎng)豐富[4]。其性平味甘，具有健脾助消，降糖消渴，清心安神之功效，亦可用于輔助治療痔瘡和糖尿病等，其多糖具有抗癌、防癌的特性[5-10]。

有植物第二基因組之稱的根際微生物群落，對(duì)植物生長有著至關(guān)重要的作用[11]，其組成及代謝影響著植物根際養(yǎng)分循環(huán)，可分為有益菌、中性菌和致病菌[12]。目前高通量測序技術(shù)日趨成熟，已在植物內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)[13-18]和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[19-22]等方面得到廣泛應(yīng)用，然而在食用菌相關(guān)研究中利用極少，也未見利用高通量測序技術(shù)研究雞腿菇菌塘土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)報(bào)道。

以西藏林芝市野生雞腿菇菌塘土壤為試驗(yàn)材料，分析野生雞腿菇菌塘土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，以期為西藏自治區(qū)野生雞腿菇馴化及土壤有益菌種的分離利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用西藏林芝市 （29°39′15.87″N，94°22′04.84″E，海拔：3 000 m）野生雞腿菇菌塘土壤為試驗(yàn)材料。手帶無菌手套，選擇10株野生雞腿菇，采集其菌塘深度為0～20 cm土壤樣品（采集時(shí)間為2020年7月），將10個(gè)土壤樣品混合，過無菌的3 mm孔徑的篩網(wǎng)，置于無菌采樣袋中用低溫采樣箱帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存?zhèn)溆谩ＴO(shè)3個(gè)重復(fù)，分別記為菌塘土壤樣本 （S1、S2、S3）。

1.2 方法

1.2.1 提取基因組DNA及PCR擴(kuò)增

依據(jù)參考文獻(xiàn)[23-24]，使用土壤DNA提取試劑盒（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）提取雞腿菇菌塘土壤樣品總DNA，用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測提取基因組DNA的濃度和質(zhì)量。擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)～V4區(qū)，引物為341F（5’-CCTAYG GGRBGCASCAG-3’） 與 806R （5’-GG ACTACNNGGGTATCTAAT-3’）。擴(kuò)增真菌 ITS區(qū)域，引物為 ITS3F （5’-GATGAAGAACGYAGYRAA-3’）和 ITS4R （5’-TCCTCCGCYYATTGATATGC-3’）。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化，隨后送至上海美吉生物科技有限公司測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析及處理

使用FLASH和fastp軟件過濾去除干擾數(shù)據(jù)，優(yōu)化測序數(shù)據(jù)并將高質(zhì)量數(shù)據(jù)拼接成Tags序列，利用Usearch軟件對(duì)上述序列進(jìn)行聚類分析[25]。按照97%的一致性聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OUT），將OTU與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)并對(duì)OTU進(jìn)行物種注釋[26-27]。利用QIIME軟件進(jìn)行 Alpha多樣性分析 Simpson、Shannon、ACE和Chao指數(shù)等[28]。R 3.0軟件繪制稀釋曲線和進(jìn)行其他數(shù)據(jù)分析[29-30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生雞腿菇菌塘土壤微生物多樣性分析

細(xì)菌和真菌稀釋曲線見圖1、圖2。

如圖1和圖2所示，Sobs指數(shù)構(gòu)建的稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明抽樣足夠充分，可以進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

圖1 細(xì)菌的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of bacteria

圖2 真菌的稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve of fungi

經(jīng)質(zhì)控過濾和去除嵌合體，3個(gè)樣本共獲得78 869條細(xì)菌高質(zhì)量序列（effective tags），在97%的相似度水平進(jìn)行聚類，見圖3。

圖3 細(xì)菌的維恩圖Fig.3 Veen diagram of bacteria

如圖3所示，從雞腿菇的菌塘土壤中總共獲得了1 899個(gè)細(xì)菌OUTs，3個(gè)樣品分別獲得了1 723個(gè)、1 696個(gè)和1 736個(gè)OUTs。3個(gè)雞腿菇的菌塘土壤樣本共有1 444個(gè)細(xì)菌OUTs，S1樣品特有27個(gè)OUTs，S2樣品特有23個(gè)OUTs，S3樣品特有37個(gè)OUTs。

3個(gè)樣本共獲得177 689條真菌高質(zhì)量序列，其在97%的相似度水平進(jìn)行聚類，維恩圖見圖4。

如圖4所示，雞腿菇的菌塘土壤中總共獲得871個(gè)真菌OUTs，3個(gè)樣品分別獲得689個(gè)、698個(gè)和648個(gè)OUTs。3個(gè)雞腿菇的菌塘土壤樣本共有492個(gè)真菌OUTs，S1樣品特有66個(gè)OUTs，S2樣品特有82個(gè)OUTs，S3樣品特有51個(gè)OUTs。

圖4 真菌的維恩圖Fig.4 Veen diagram of fungi

Alpha多樣性分析結(jié)果見表1。

表1 雞腿菇菌塘土壤微生物群落Alpha多樣性分析Tab.1 Alpha diversity analysis of microbial community from rhizosphere soil of Coprinus comatus

如表1所示，各樣品細(xì)菌本文庫的覆蓋度均≥99.03%，各樣品真菌本文庫的覆蓋度均≥99.82%，能夠代表相應(yīng)樣本中細(xì)菌或真菌的真實(shí)信息。

2.2 野生雞腿菇菌塘土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成

雞腿菇菌塘土壤細(xì)菌共鑒定出9個(gè)門，分析結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 根際土壤細(xì)菌門水平群落組成Fig.5 The bacteria community composition of rhizosphere soil at phylum level

圖6 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的熱圖分析（屬水平）Fig.6 Heatmap analysis of bacterial community structure at genus level

如圖5所示，放線菌門為優(yōu)勢門，按所占比例依次分別為：放線菌門（Actinobacteriota） 31.52%、變形菌門 （Proteobacteria） 29.05%、綠彎菌門（Chloroflexi）11.58%、酸桿菌門（Acidobacteriota）10.90%、擬桿菌門（Bacteroidota） 6.64%、黏菌門（Myxococcota） 2.39%、芽單胞菌門（Gemmatimonadota） 2.25%、髕骨細(xì)菌門（Patescibacteria） 2.13%和厚壁菌門（Firmicutes） 0.61%。

如圖6所示，在屬水平，雞腿菇菌塘土壤細(xì)菌群落中67-14_norank（分類學(xué)譜系中無該類層級(jí)的科學(xué)名稱，標(biāo)記為norank）為優(yōu)勢菌屬，RB41為相對(duì)優(yōu)勢屬，占比超過1.00%屬有16屬，分別為：67-14_norank（3.48%）、KD4-96_norank（3.26%）、Vicinamibacterales_norank（2.39%）、RB41（2.18%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，1.98%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，1.93%）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides，1.82%）、Ellin6055（1.78%）、Roseiflexaceae_norank（1.77%）、 IMCC26256_norank（1.67%）、Gaiellales_norank（1.61%）、Gemmatimonadaceae_norank（1.57%）、分枝桿菌屬（Mycobacterium，1.51%）、Vicinamibacteraceae_norank（1.48%）、Xanthobacteraceae_norank（1.45%） 和黃桿菌屬（Flavobacterium，1.42%）。

雞腿菇菌塘土壤真菌共鑒定出4個(gè)門，分析結(jié)果見圖7、圖8。

圖7 根際土壤真菌門水平群落組成Fig.7 The fungal community composition of rhizosphere soil at phylum level

圖8 真菌群落結(jié)構(gòu)的熱圖分析（屬水平）Fig.8 Heatmap analysis of fungal community structure at genus level

如圖7所示，子囊菌門為該樣品中的優(yōu)勢門，按所占比例依次分別為：子囊菌門（Ascomycota）73.94%、擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 18.11%、Fungi_unclassified（3.34%）和被孢霉門（Mortierellomycota）3.17%。

如圖8所示，雞腿菇菌塘土壤真菌群落在屬水平以谷菌根菌屬（Archaeorhizomyces） 為優(yōu)勢菌屬，占比超過1.00%屬有13屬（分類學(xué)譜系中未分類的科學(xué)名稱，標(biāo)記為unclassified），分別為：谷菌根屬（Archaeorhizomyces，16.50%）、Ascomycota_unclassified（14.51%）、Pezizales_unclassified（8.24%）、Knufia（5.40%）、 Hygrophoraceae_ unclassified（5.05%）、鬼傘屬（Coprinus，4.41%）、枝孢需屬（Cladophialophora，4.02%）、Lasiosphaeriaceae_unclassified（3.53%）、Fungi_unclassified（3.34%）、A－garicales_unclassified（3.17%）、被孢霉屬（Mortierella，3.16%）、外瓶柄霉屬 （Exophiala，3.06%）。

由圖6、圖8可直觀看出，3個(gè)樣品微生物物種群落組成在屬水平上的異同及豐富度，無論是土壤細(xì)菌還是部分土壤真菌在3個(gè)樣品中的分布均存在一定差異。雞腿菇菌塘土壤細(xì)菌以67-14_norank為優(yōu)勢菌屬，與上述群落組成結(jié)果一致。雞腿菇菌塘土壤真菌以谷菌根菌屬（Archaeorhizomyces）為優(yōu)勢屬，與上述群落組成結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

雞腿菇營養(yǎng)豐富、保健功能突出，備受人們青睞，市場前景廣闊，因此進(jìn)行野生雞腿菇馴化和穩(wěn)產(chǎn)創(chuàng)收的相關(guān)研究很有必要。通過采用高通量測序技術(shù)解析西藏林芝市野生雞腿菇菌塘土壤微生物群落組成，優(yōu)勢菌屬及有益菌屬，可為西藏自治區(qū)野生雞腿菇的馴化和栽培提供參考。

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析中，菌塘土壤中RB41為相對(duì)優(yōu)勢屬，豐富度較高的菌屬有慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、類諾卡氏菌屬 （Nocardioides）、Ellin6055、分枝桿菌屬（Mycobacterium） 和黃桿菌屬（Flavobacterium）。研究表明，慢生根瘤菌屬能夠降低植物體內(nèi)的乙烯含量，從而促進(jìn)植物生長[31]。鞘氨醇單胞菌屬是一類可清除土壤有毒物質(zhì)且廣布于土壤的細(xì)菌類群[32-33]，部分菌株能合成分泌有機(jī)物，便于植物吸收利用[34-35]。黃桿菌屬部分菌種具有降解無機(jī)磷的能力[36]。

真菌群落結(jié)構(gòu)分析表明，菌塘土壤真菌群落中谷菌根菌屬（Archaeorhizomyces） 為優(yōu)勢菌屬，豐富度較高的真菌類群有Knufia、鬼傘屬（Coprinus）、枝孢需屬（Cladophialophora）、被孢霉屬（Mortierella）、外瓶柄霉屬 （Exophiala）。枝孢需屬（Cladophialophora） 中 Cladophialophora chaetospira SK51菌株不僅具有促進(jìn)植物生長的活性還具有良好的抑病活性[37]。被孢霉屬作為一類解磷真菌，能釋放磷于土壤，且參與土壤碳磷循環(huán)[38-39]。