衛(wèi)國(guó)紅，王 利，萬(wàn)學(xué)思，譚泳謠

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2保健科，廣東 廣州 510080；3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510080

胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（PNENs）是胰腺上皮樣腫瘤中第2常見(jiàn)的腫瘤，其病死率高達(dá)60%［1,2］。盡管如此，因其發(fā)病率較低，臨床癥狀和體征常不典型，一直在臨床上被忽視而對(duì)其研究不足，導(dǎo)致近30 年來(lái)我國(guó)PNENs病例數(shù)量呈顯著上升，但患者生存期卻無(wú)明顯改善［3,4］。胰島素瘤是功能性PNENs中最為常見(jiàn)的一種，胰島素瘤的典型臨床表現(xiàn)為Whipple三聯(lián)征，但該病實(shí)際臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，由于其引起的低血糖癥狀及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀往往與其他疾病類似，加之超聲、CT的確診率不高，均需由多科室會(huì)診，臨床上無(wú)法依據(jù)胰島素瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)來(lái)判斷其良惡性質(zhì)，目前亦無(wú)可靠臨床指標(biāo)及分子標(biāo)記物以用于區(qū)分良、惡性胰島素瘤［4］，極易漏診及誤診［5,6］。特別重要的是，正因?yàn)镻NENs病程進(jìn)展非常緩慢，確診時(shí)大多已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移性PNENs的5年生存率低至27%［7,8］，這給胰島素瘤的臨床治療提出了非常大的挑戰(zhàn)。同時(shí)，胰島素瘤中常見(jiàn)癌基因（myc,ras等）與抑癌基因（p53,Rb,p16等）表達(dá)均無(wú)明顯異常變化［5,6,9］，因此針對(duì)胰島素瘤為主的PNENs新的診斷生物標(biāo)志物亟待闡明。

ELF4屬于ETS轉(zhuǎn)錄因子家族，是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及腫瘤免疫中至關(guān)重要的癌基因［10］。ELF4是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化不可或缺的因子，研究發(fā)現(xiàn)在Elf4（-/-）p53（-/-）的胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）中，甚至癌基因H-Ras(V12)或者c-myc均不能使得MEF細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［10］。ELF4與神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，發(fā)揮著如抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖及促進(jìn)腫瘤血管新生等生物學(xué)功能［11,14］。本研究擬探究胰島素瘤中ELF4表達(dá)是否與其腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。

胰島素瘤等PNEN疾病臨床上少見(jiàn)，導(dǎo)致病例及組織標(biāo)本的稀缺成為限制其發(fā)病機(jī)制研究的瓶頸，目前尚無(wú)理想模擬其發(fā)生發(fā)展的動(dòng)物模型［2,9］。因此，國(guó)內(nèi)外關(guān)于胰島素瘤發(fā)生、發(fā)展及演進(jìn)研究尚未明確，目前的研究表明胰島細(xì)胞增殖失控是導(dǎo)致胰島素瘤發(fā)生的主要機(jī)制之一，而細(xì)胞過(guò)度增殖及抗凋亡的分子機(jī)制一直尚未明確。胰島素瘤細(xì)胞增殖和抗凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵因子有待進(jìn)一步闡明。

本研究以ELF4外源穩(wěn)定高表達(dá)的胰島素瘤BON細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)ELF4高表達(dá)可以促進(jìn)人胰島素瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)增強(qiáng)人胰島素瘤細(xì)胞抗凋亡能力，并闡明其機(jī)制是通過(guò)激活A(yù)kt通路而促進(jìn)胰島素瘤細(xì)胞增殖和抗凋亡。本研究為闡明ELF4在胰島素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)理提供新的線索，并為胰島素瘤的診斷預(yù)后標(biāo)志或治療提供可能的新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)試劑

人胰島素瘤細(xì)胞系BON（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)），凍存于本實(shí)驗(yàn)室液氮罐。胎牛血清FBS、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、PBS均（Gibco）；表阿霉素（EPI）（Selleck）；抗ELF4抗體（Invitrogen），抗caspase-8前體抗體、抗caspase-8切割成熟體抗體、抗caspase-9前體抗體、抗caspase-9切割成熟體抗體、抗PARP前體抗體、抗PARP成熟體抗體、抗磷酸化Akt抗體（Thr308位點(diǎn)）、抗磷酸化Akt抗體（Ser473位點(diǎn)）、抗總Akt體、抗Actin抗體均（Cell Signaling Technology）。MTT（Genview）；DMSO（Sigma）。

1.2 外源穩(wěn)定高表達(dá)ELF4蛋白的細(xì)胞系的構(gòu)建

通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體（pMSCV），構(gòu)建質(zhì)粒pMSCV-puro-ELF4-Flag，與包裝質(zhì)粒pIK用磷酸鈣法共轉(zhuǎn)HEK-293T細(xì)胞，制備病毒液，然后感染人胰島素瘤細(xì)胞系BON。在培養(yǎng)基中添加嘌呤霉素作為細(xì)胞篩選標(biāo)志物，并連續(xù)傳代細(xì)胞，以篩選建立穩(wěn)定高表達(dá)ELF4的細(xì)胞株（實(shí)驗(yàn)組BON-ELF4）。構(gòu)建載體對(duì)照組細(xì)胞BON-Vector。

收集和抽提第5代細(xì)胞的總蛋白，采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)證明穩(wěn)定高表達(dá)ELF4的細(xì)胞BON-ELF4是否構(gòu)建成功。

1.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

收集各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液，充分裂解消化細(xì)胞獲得總蛋白裂解液樣品，采用BCA法進(jìn)行各組蛋白定量后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；等待電泳完成后，準(zhǔn)備6張Whatman 3M專用濾紙和1張PVDF膜，甲醇浸泡PVDF膜5 min，將夾子、海綿和專用濾紙浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中；取出SDS-PAGE凝膠，徹底去除濃縮膠部分，并把濾紙和PVDF膜裁成凝膠大?。话措娹D(zhuǎn)印裝置操作，負(fù)極-海綿-3 張濾紙-濃縮凝膠-PVDF膜-3張濾紙-海綿-正極板，將其放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液中；冰浴，按照300 mA 電流設(shè)置轉(zhuǎn)膜2 h；取出PVDF膜，使用含5%脫脂牛奶的TBST封閉液封閉1 h；然后，采用待測(cè)蛋白的一抗抗體4 ℃過(guò)夜孵育，TBST洗膜，15 min/次，重復(fù)3次；采用相應(yīng)的二抗抗體孵育1 h；TBST洗膜，15 min/次，重復(fù)3次；在暗房采用X片發(fā)光顯影定影而獲得數(shù)據(jù)圖。數(shù)據(jù)圖中條帶，經(jīng)掃描后使用Quantity One v4.6.2軟件測(cè)算出總體灰度值，并計(jì)算出相對(duì)灰度值：目的條帶的總體灰度值/相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參條帶總體灰度值。

1.4 MTT比色法

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BON-ELF4和BON-Vector細(xì)胞，用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/mL，取200 μL細(xì)胞每孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，共設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每間隔24 h，在超凈工作臺(tái)內(nèi)每孔加MTT（5 mg/mL）20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，連續(xù)測(cè)定6 d。用5 cc的注射器小心的吸去培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO 置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。最后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm處測(cè)量各孔的吸光值A(chǔ)570nm。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將各組細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育培養(yǎng)處理24 h后，去除培養(yǎng)基，隨后分別用0.25%胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，采用DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，800g離心5 min，棄去上清。采用1×PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，收集5×105細(xì)胞。加入500 μL的凋亡檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）中提供的緩沖液懸浮細(xì)胞后，加入5 μLAnnexin V-FITC 混勻，再加入5 μL碘化丙錠（PI），混勻，室溫避光反應(yīng)10 min。然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm；發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm，Annexin V-FITC 的綠色熒光通過(guò)FITC 通道（FL1）檢測(cè)；PI 紅色熒光通過(guò)PI 通道（FL3）。熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對(duì)照進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。采用FlowJo 7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用軟件SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立了ELF4高表達(dá)的人胰島素瘤細(xì)胞BON-ELF4

應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建ELF4穩(wěn)定高表達(dá)人胰島素瘤細(xì)胞系BON。Western blot顯示BONELF4細(xì)胞中ELF4蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組細(xì)胞BONVector（P=0.013，圖1），穩(wěn)定高表達(dá)外源性ELF4蛋白的細(xì)胞系BON-ELF4構(gòu)建成功。

圖1 建立ELF4穩(wěn)定高表達(dá)的胰島素瘤細(xì)胞BON細(xì)胞模型Fig.1 Establishment of BON-ELF4 cell line that stably overexpresses ectopic ELF4.A:Western blotting for detecting ELF4 in BON cells.B:Quantitative analysis of EFL expression using Quantity One software.*P=0.013 vs BON-Vector group.

2.2 高表達(dá)ELF4能促進(jìn)人胰島素瘤細(xì)胞增殖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從第3 天開(kāi)始，相比較于BON 細(xì)胞，穩(wěn)定高表達(dá)ELF4的細(xì)胞系BON-ELF4生長(zhǎng)明顯較快（P<0.01，圖2）。

圖2 MTT 法檢測(cè)胰島素瘤細(xì)胞BON-ELF4 和BON-Vector的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of BON-ELF4 cells and BONVector cells generated based on the results of MTT assay(**P<0.01 vs BON-Vector group).

2.3 高表達(dá)ELF4能增強(qiáng)人胰島素瘤細(xì)胞抗凋亡能力

采用抗腫瘤化療藥物表阿霉素（EPI）作為凋亡誘導(dǎo)劑，根據(jù)EPI的對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度IC50，以及我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)參考結(jié)果，發(fā)現(xiàn)選定0.1 μmol/L 作用24 h后可有效誘發(fā)BON-Vector腫瘤細(xì)胞的凋亡。而后通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)caspase 激活情況，相比較于載體對(duì)照組BON-Vector，BON-ELF4 細(xì)胞在0.1 μmol/L EPI 處理24 h 后caspase-8、caspase-9 蛋白前體降低，而caspase-8、caspase-9 成熟體切割帶增強(qiáng)（P<0.05，圖3）。同時(shí)，相應(yīng)的PARP切割帶隨著ELF4的高表達(dá)而降低（P<0.05，圖3）。采用Annexin V-FITC/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析，結(jié)果顯示，在0.1 μmol/L EPI處理各組細(xì)胞24 h后，22.90%的載體對(duì)照組BON-Vector細(xì)胞呈現(xiàn)出Annexin V陽(yáng)性、PI陰性的早期凋亡結(jié)果，6.03%的BON-ELF4細(xì)胞組呈現(xiàn)出Annexin V陽(yáng)性、PI陰性的早期凋亡結(jié)果（圖4）。

圖3 EPI處理的各組腫瘤細(xì)胞中caspase-8、caspase-9及PARP的表達(dá)水平Fig.3 Expression cleaved caspase-8,caspase-9 and PARP in BON-ELF4 cells and BON-Vector cells following epirubicin treatment.

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組腫瘤細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Epirubicin-induced apoptosis of BON-Vector and BON-ELF4 cells analyzed using flow cytometry with annexin V-FITC/PI staining.

2.4 ELF4能夠激活胰島素瘤細(xì)胞內(nèi)Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

檢測(cè)BON-ELF4和BON-Vector細(xì)胞中Akt的磷酸化水平結(jié)果顯示，與載體轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)照細(xì)胞相比，外源高表達(dá)ELF4的腫瘤細(xì)胞中Akt的磷酸化升高（P<0.05），而Akt總蛋白的水平基本未受影響（P>0.05，圖5）。

圖5 胰島素瘤細(xì)胞BON-ELF4和BON-Vector細(xì)胞中Akt磷酸化水平Fig.5 Expressions of phosphorylated Akt and total Akt in BON-ELF4 cells and BON-Vector cells.

3 討論

本研究證明了ELF4可促進(jìn)胰島素瘤細(xì)胞的增殖以及抵抗凋亡，并闡明其作用機(jī)理為激活了腫瘤細(xì)胞內(nèi)Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可為胰島素瘤的診斷預(yù)后標(biāo)志或治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

ELF4屬于ETS轉(zhuǎn)錄因子家族成員，能作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在IL-8、perforin、GM-CSF及IL-3等基因的啟動(dòng)子上，而啟動(dòng)基因表達(dá)［11］。研究表明，在小鼠的Elf4基因敲除后，并不會(huì)使得小鼠在胚胎期死亡。這提示ELF4或許是功能冗余，或許是在生理生化及發(fā)育過(guò)程中起到一定的作用［11,12］。另外，ELF4還能與細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用，在機(jī)體天然免疫中起到調(diào)控作用，細(xì)胞靜息狀態(tài)下，ELF4以非活性狀態(tài)游離于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)PRRs識(shí)別病原體后，誘導(dǎo)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的接頭蛋白STING與ELF4的C端發(fā)生相互作用，并招募TBK1繼而磷酸化ELF4，隨后激活狀態(tài)的ELF4轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，進(jìn)而增強(qiáng)了IRF3，IRF7以及p65與EICE的親和力，最終促進(jìn)I型干擾素的產(chǎn)生［13］。目前發(fā)現(xiàn)I型和II型干擾素通路的激活均是抗腫瘤免疫的重要環(huán)節(jié)［14,16］，本研究發(fā)現(xiàn)ELF4可激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)Akt通路，而以往研究報(bào)道PI3K/Akt通路也是I型干擾素的產(chǎn)生的關(guān)鍵通路［17,18］。由此提示，ELF4可能可以通過(guò)Akt通路激活I(lǐng)型、II型或者III型干擾素的產(chǎn)生，亟待深入研究。因此，ELF4在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤免疫系統(tǒng)中都扮演著非常重要的作用。

目前在腫瘤研究領(lǐng)域，ELF4作為抑癌或者促癌的研究都有報(bào)道。ELF4是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化不可或缺的因子，研究發(fā)現(xiàn)在Elf4（-/-）p53（-/-）的胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）中，甚至癌基因H-Ras(V12)或者c-myc均不能使得MEF惡性轉(zhuǎn)化［10］。其調(diào)控細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制主要是通過(guò)促進(jìn)Mdm2 的表達(dá)，下調(diào)P53 依賴的反應(yīng)，抑制INK4a的激活，從而導(dǎo)致Rb蛋白的磷酸化。研究表明，MDM2的磷酸化是其從細(xì)胞質(zhì)移位進(jìn)入細(xì)胞核的關(guān)鍵，MDM2需要定位到細(xì)胞核內(nèi)才能與p53相互作用，而MDM2的磷酸化主要依賴與Akt激酶［19,20］，本研究發(fā)現(xiàn)ELF4可激活A(yù)kt通路，因此提示ELF4可能是MDM2重要上游調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)ELF4在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中異常高表達(dá)，其可通過(guò)直接激活機(jī)體細(xì)胞內(nèi)Sox2的表達(dá)從而賦予其干細(xì)胞特性，促使神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的形成［21］。也有研究發(fā)現(xiàn)ELF4在卵巢癌中呈上調(diào)表達(dá)，并且通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明ELF4能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞過(guò)度增殖，能夠在裸鼠體內(nèi)促進(jìn)卵巢癌失控性生長(zhǎng)［22］。然而在急性髓性白血病中，ELF4則是作為一個(gè)抑癌基因起作用［23］。本研究發(fā)現(xiàn)ELF4高表達(dá)可以促進(jìn)人胰島素瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)增強(qiáng)人胰島素瘤細(xì)胞抗凋亡能力，并闡明其機(jī)理是通過(guò)激活A(yù)kt通路而促進(jìn)胰島素瘤細(xì)胞增殖和抗凋亡。由此說(shuō)明ELF4的功能具有一定的多樣性，在不同類型腫瘤中，由于ELF4定位在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中而發(fā)揮功能的差異性，可能激活完全不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而其原因可能是在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合的關(guān)鍵蛋白因子不同。圍繞ELF4的精細(xì)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主題，本課題組擬將繼續(xù)深入探究。本研究為闡明ELF4在胰島素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)理提供新的線索，并為胰島素瘤的診斷預(yù)后標(biāo)志或治療提供可能的新靶點(diǎn)。