田春洋,洪明生,龍玨潔,謝建妹*

1.四川栗子坪國家級自然保護區(qū)管理局，四川雅安 625400；

2.西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充 637009

大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）是中國的特有瀕危物種，是典型的森林土著物種，加上它憨態(tài)可掬的外貌特征，受到了世界人民的喜愛。由于道路建設(shè)、森林采伐、竹子開花、采藥以及放牧等干擾因素的影響，現(xiàn)存的1864只野生個體被分割于中國西南部的秦嶺、岷山、邛崍、大相嶺、小相嶺和涼山等六大山系中[1-5]。竹子作為大熊貓主要的食物來源，是大熊貓保護的關(guān)鍵之一。四川省大熊貓棲息地內(nèi)大熊貓可采食的竹類有7屬32種，其中小相嶺山系大熊貓棲息地內(nèi)大熊貓可采食竹類3屬7種，其中面積最大的為峨熱竹（Arundinaria spanostachya），占該山系大熊貓棲息地內(nèi)大熊貓取食竹總面積的38.08%[6]。由于道路建設(shè)等因素，該小相嶺山系的大熊貓局域種群形成了孤立的小種群，易受到外來因素的干擾而滅絕[6]。

四川栗子坪國家級自然保護區(qū)位于小相嶺山系，行政區(qū)域上位于石棉縣南部，地理坐標為北緯28°51'02″—29°08'42″，東經(jīng)102°10'33″—102°29'07″。整個保護區(qū)占地面積為47 885 km2。保護區(qū)內(nèi)最高的海拔為4 551 m，最低的海拔為1 330 m，地勢西南高、東北低。區(qū)內(nèi)的年平均溫度為11.7℃～14.4℃，年平均降水量為800～1250 mm。隨著海拔的升高，區(qū)內(nèi)植被類型從常綠闊葉林變?yōu)獒樔~林，在高海拔區(qū)域分布的植被類型有高山灌叢、草甸、流石灘等[3]。保護區(qū)內(nèi)可供大熊貓取食的竹類有峨熱竹、石棉玉山竹（Yushania lineolata）、豐實箭竹（Fargesia ferax）等，除冬季少量采食石棉玉山竹外，該區(qū)域的大熊貓全年主要采食峨熱竹，該竹類主要分布在區(qū)內(nèi)海拔約2800 m以上的區(qū)域[4]。

在植物葉部周圍寄生或是附著有大量的微生物，這些微生物有真菌、細菌等[7]。在植物葉圍微生物中，細菌的豐富度最高，并與植物葉面形成了一個微生物-植物相互作用的微生態(tài)系統(tǒng)[7]。葉面微生物不僅影響植物的生長，還能通過競爭養(yǎng)分和拮抗作用等來抑制植物表面病原菌的生長，對于防治植物病害有極大的作用，然而存在的致病菌也會導(dǎo)致植物患病[7?9]。例如，鞘脂桿菌屬（Sphingobium）和鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）的一些物種被證明能降解很多有機污染物[10?11]；甲基桿菌屬（Methylobacterium）和假單胞桿菌屬（Pseudomonas）的物種被報道有植物生長促進劑的潛能[12?14]。影響葉圍微生物群落的因素非常多，就生物因素而言，有植物種類、基因型等，例如擬南芥單基因lacs2和pec1突變能改變其葉際微生物的組成[15?16]。就非生物因素而言，紫外壓力、空氣濕度、地理位置、生長季節(jié)等影響葉圍微生物組成、多樣性等，例如地理位置被證明是大田萵苣微生物的主要驅(qū)動因子[17]。因此，葉圍微生物的組成、多樣性等對于維護植物健康具有十分重要的作用，其影響因素也非常多。

本研究以四川栗子坪國家級自然保護區(qū)內(nèi)峨熱竹竹葉為實驗材料，通過室內(nèi)微生物學(xué)分析、高通量擴增子測序技術(shù)等手段，探討小相嶺山系四川栗子坪國家級自然保護區(qū)內(nèi)野生大熊貓主食竹峨熱竹葉圍細菌組成、多樣性的季節(jié)性變化，以期為野生大熊貓食物資源的科學(xué)管理提供參考依據(jù)。

1 研究方法

1.1 樣品收集和處理

在四川栗子坪國家級自然保護區(qū)峨熱竹分部區(qū)域設(shè)置采樣點，分別于2020年4月至2020年5月（春季）以及2020年10月（秋季）采集峨熱竹竹葉，兩個季節(jié)各采集樣品16個。每個竹葉樣品不低于200 g，并在4 h內(nèi)運回保護站存于?20℃冰箱中，并在兩天內(nèi)進行葉圍微生物的洗脫處理。

將竹葉樣品用TE-buffer（10 mM Tris,1 mM EDTA,pH 7.5）進行洗脫、離心并收集菌泥[18?20]，并參照說明書對菌泥用E.Z.N.A.TMSoil DNA Kit（Omega Norcross,GA,U.S.）進行基因組DNA提取。將符合DNA擴增純度和濃度的樣品送往上海美吉生物有限公司進行后續(xù)實驗。

1.2 16Sr RNA序列的擴增和測序

首先進行DNA的樣品質(zhì)檢，在進行DNA純度檢測時采用NanaDrop2000，采用瓊脂糖凝膠電泳進行DNA完整性檢測。檢測結(jié)果顯示DNA的純度和DNA的完整度都符合后續(xù)擴增的要求。其次進行PCR的擴增，在進行擴增的過程中，為了兼顧擴增特異性，同時避免因測序的序列太長而造成其他有誤的影響，選用細菌16SrRNA基因V3-V4高變區(qū)進行擴增（引物為338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）[19]。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后進行末端補齊，加尾和測序連接頭后利用Illumina Hi Seq 2000平臺進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將所得原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進行拼接，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2。使用的UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDPclassifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋，比對16SrRNA基因數(shù)據(jù)庫。去除可能被洗脫微生物時混入的竹葉組織葉綠體和線粒體污染的序列。

基于OTU百分比計算細菌微生物的組成和相對豐度，并使用秩和檢驗（wilcoxon rank-sum test）不同季節(jié)峨熱竹葉圍細菌在門水平和屬水平上的差異性。利用Mothur軟件計算樣品的Alpha多樣性，包括Sobs和Shannon等指數(shù)，使用秩和檢驗不同季節(jié)峨熱竹葉圍細菌Alpha多樣性之間的差異性。通過QIIME（v1.80）計算峨熱竹葉圍微生物群落的Beta多樣性，包括weighted Unifrac和unweighted Unifrac指數(shù)，并且使用R語言PCoA統(tǒng)計分析并作圖，計算基于OTU水平的不同季節(jié)峨熱竹葉圍細菌weighted UniFrac distances和unweighted UniFrac distances距離下微生物結(jié)構(gòu)的相似性和差異性，并使用ANOSIM分析檢驗其差異性水平[19,21-23]。

2 結(jié)果

2.1 峨熱竹葉圍細菌組成的季節(jié)性變化

去除葉綠體和線粒體序列后，基于97%的相似度對序列進行聚類共獲得1796個OTUs，其中，春季和秋季共有934個OUTs，春季獨有101個OUTs，秋季獨有761個OUTs。將相對豐度百分比小于1%的歸類為others后，發(fā)現(xiàn)峨熱竹葉圍主要有變形菌門（Proteobacteria）、酸菌門（Acidobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）和扁平菌門（Planctomycetota）等5個菌門（見圖1），其中變形菌門最為豐富。春季峨熱竹葉圍酸菌門細菌的相對豐度顯著大于秋季峨熱竹葉圍酸菌門細菌相對豐度（見圖1，P<0.01），而變形菌門細菌的相對豐度顯著小于秋季變形菌門細菌的相對豐度（見圖1，P<0.05）。

圖1 不同季節(jié)峨熱竹葉圍細菌在門水平上的相對豐度差異性比較Fig.1 Community taxonomy of A. spanostachya phyllosphere bacteria on phylum level in different seasons (*<0.05;**<0.01)

在屬水平，峨熱竹葉圍上主要分布有1174-901-12屬、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Granulicella、嗜酸菌屬（Acidiphilium）、未被分類的醋桿菌屬（unclassified-f-acetobacteraceae）、薄層菌屬（Hymenobacter）、Terriglobus、假單胞菌屬（Pseudomonas）等屬的細菌（見圖2）。其中，春季峨熱竹葉圍的1174-901-12、Granulicella、unclassifiedf-acetobacteraceae、嗜酸菌屬（Acidiphilium）、薄層菌屬（Hymenobacter）、Endobacter、Bryocella等屬細菌的相對豐度顯著大于秋季（見圖2）。而鞘氨醇單 胞 菌 屬（Sphingomonas）、Mucilaginibacter、unclassified-f-Beijerinckiaceae、Massilia、norank-f-Acetobacteraceae、Pedobacter等屬細菌則是春季的顯著小于秋季（見圖2）。

圖2 不同季節(jié)峨熱竹葉圍細菌在屬水平上的相對豐度及其差異性檢驗Fig.2 Community taxonomy of A.spanostachya phyllosphere bacteria on genus level in different seasons(*<0.05;**<0.01;***<0.001)

2.2 峨熱竹葉圍細菌α多樣性的季節(jié)性變化

α多樣性是指通過單樣本的多樣性分析反映樣品內(nèi)的微生物群落的豐富度和多樣性，包括Sobs index、Shannon index等[15,21-22]。Sobs index表示樣本中觀察到的細菌數(shù)目，而Shannon index表示菌群多樣性，包括了物種的數(shù)目和多度。使用QIIME軟件分別對每個樣品計算Sobs index和Shannon index。分析發(fā)現(xiàn)，峨熱竹葉圍細菌的Sobsindex和Shannon index均是秋季顯著大于春季（見圖3）。

圖3 基于OTU水平的不同季節(jié)峨熱竹葉圍細菌α多樣性（Sobs index、Shannon index）差異性比較Fig.3 Alpha diversity (a:Sobsindex; b:Shannon index)of A. spanostachya phyllosphere bacteria on OTU level in different seasons(***<0.001)

2.3 峨熱竹葉圍細菌β多樣性的季節(jié)性變化

PCoA分析（Principal coordinates analysis），即主坐標分析，是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，可用來研究樣本群落組成的相似性或差異性，是β多樣性分析中常用的一種方法[15,21-22]?；贠TU水平的不同季節(jié)峨熱竹葉圍細菌主坐標分析發(fā)現(xiàn)，春季和秋季峨熱竹葉圍細菌在weighted-UniFrac distance和unweighted-UniFrac distance的群落結(jié)構(gòu)上具有顯著差異性（weighted-UniFrac distance,R=0.74,P<0.001;unweighted-UniFrac distance,R=0.78,P<0.001），其第1主成分貢獻率分別達到了44.86%和23.33%（見圖4）。

圖4 基于OTU水平的不同季節(jié)峨熱竹葉圍細菌主坐標分析（PCoA）。Fig.4 Principal coordinates analysis(PCoA analysis)of A. spanostachya phyllosphere bacteria on OTU level in different seasons

3 討論

本研究中，在春季峨熱竹葉圍菌群獨有101個OUT，占序列總數(shù)的5.62%；在秋季獨有761個OUT，占序列總數(shù)的42.37%。秋季的細菌豐度遠高于春季，這可能是溫度變化等因素造成的，此外，葉圍營養(yǎng)不足等狀況也與細菌菌群的多樣性有關(guān)[9,18]。

同一竹種在不同季節(jié)中的優(yōu)勢菌存在差異，本研究發(fā)現(xiàn)在所有樣品中，除去others共檢測到5個菌門，分別是變形菌門(Proteobacteria)、酸菌門(Acidobacteriota)、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）和扁平菌門（Planctomycetota），其中豐度最大的優(yōu)勢菌門是變形菌門(Proteobacteria)。在屬水平上，春季和秋季的菌群組成有一些差異，除去others后，春季有19個屬，其中占比超過5%的屬有1174-901-12屬、Granulicella屬、未被分類的醋桿菌屬（unclassified-f-acetobacteraceae）、嗜酸菌屬（Acidiphilium）、薄層菌屬（Hymenobacter）、Terriglobus屬。優(yōu)勢菌屬為1174-901-12屬，獨有屬為Bryocella屬和Tundrisphaera屬。秋季除去others后還剩20個屬，其中占比超過5%的屬有1174-901-12屬、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Granulicella屬、假單胞菌屬（Pseudomonas）。優(yōu)勢菌屬是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），獨有屬是土地桿菌屬（Pedobacter）。以上結(jié)果與前人對竹種葉部微生物的研究結(jié)果相符[24]；具有降解有機物的鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）和具有植物促進劑的潛能的假單胞桿菌屬（Pseudomonas）等植物有益微生物在秋季峨熱竹葉圍的顯著增加，有利于該竹種的健康和生長[10-14]。造成不同季節(jié)中優(yōu)勢菌存在差異的原因可能是在不同的生長狀態(tài)和生理時期下，竹種葉圍微生物會有不同的適應(yīng)性，這會直接導(dǎo)致微生物的種群組成和優(yōu)勢菌在季節(jié)上的差異。

有學(xué)者在研究不同竹種的營養(yǎng)成分對大熊貓腸道影響時發(fā)現(xiàn)，不同情況下大熊貓腸道中均表現(xiàn)為變形菌門（Proteobacteria）、酸菌門（Acidobacteriota）、扁平菌門（Planctomycetes）和厚壁菌門（Firmicutes）占主導(dǎo)，其中變形菌門豐富度最高[25]，大量對大熊貓、小熊貓的腸道菌群研究對結(jié)果表明，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是大熊貓、小熊貓胃腸道的優(yōu)勢門[20,26-28]，變形菌門最為豐富的結(jié)果與我們的研究結(jié)果類似。

從香農(nóng)指數(shù)和Sobs指數(shù)的分析結(jié)果中可以看出，峨熱竹的細菌菌群在春季和秋季之間存在非常明顯的差異，并且是秋季中細菌菌群的多樣性和豐富度遠遠高于春季中細菌菌群的多樣性和豐富度，這進一步說明，季節(jié)性變化導(dǎo)致了細菌菌群出現(xiàn)了顯著差異。這與前人對四川省6種竹葉部微生物的研究結(jié)果一致，該研究結(jié)果也證明竹種微生物類群的豐富度指數(shù)在秋季達到最高值[29]。在四川地區(qū)春季的氣候特征分別表現(xiàn)為低溫多雨，這樣的特征不利于微生物在葉表面附著，而秋季擁有更為高溫潮濕的氣候條件，這便使得大多數(shù)微生物可以附著在葉表面，并且進行大量繁殖等生命活動，因此葉表面的微生物豐富度指數(shù)在秋季高于春季。基于PCoA分析的結(jié)果表明峨熱竹春季的細菌群落和秋季的細菌群落有著明顯的不同，再次說明了細菌菌群在不同季節(jié)間具有顯著差異[9,18,25]。

保護大熊貓主食竹已經(jīng)成為保護大熊貓的一種重要手段，四川栗子坪國家級自然保護區(qū)中峨熱竹又是大熊貓的主要采食竹，因此對峨熱竹對科學(xué)保護是該山系大熊貓保護對重要內(nèi)容。本研究表明，峨熱竹葉圍細菌菌群中變形菌門（Proteobacteria）占優(yōu)勢，該門細菌也是大熊貓腸道微生物中的優(yōu)勢菌群，因此該門細菌優(yōu)勢度的變化可能對該山系大熊貓腸道健康產(chǎn)生潛在影響。另外，對植物有益的鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和假單胞桿菌屬（Pseudomonas）細菌在秋季顯著增加且為主要菌群，然而在春季并不是優(yōu)勢菌群，因此在其他季節(jié)（包括春季）檢測該類菌群的分布和活性有利于了解不同季節(jié)峨熱竹葉圍有益微生物的狀況。以上研究結(jié)果有助于了解不同季節(jié)小相嶺山系峨熱竹的葉圍細菌菌群的差異性，為大熊貓主食竹資源的保護和科學(xué)管理提供參考依據(jù)。