黃 鑫，師凱輝，胡 凇，田英男，馮 壘，韓欣妤，孫 博，王義琴，王冬梅，何 玲, 朱永平，和鳳美

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明 650201)

MADS-box基因是一類序列特異的調(diào)節(jié)基因家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起著重要的作用。SEP類基因作為參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育功能的一類基因，也屬于MADS-box基因的一員。一開(kāi)始，學(xué)者們對(duì)關(guān)于花器官形成的研究，總結(jié)出了經(jīng)典的ABC模型，換而言之，就是花器官的形成主要與A、B和C 3類功能基因相關(guān)，而隨著SEP類基因功能的揭示，ABC模型升級(jí)為ABCE模型，即每一輪花器官的發(fā)育都需要E類基因的參與，而E類基因中的SEP1/2/3是研究者在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，并且可以與ABCE 4類功能基因一起參與花器官的發(fā)育和調(diào)控。目前研究者研究了擬南芥（Arabidopsis thaliana）、桃（Amygdalus persica）、金釵石斛（Dendrobium nobile）、蘆筍（Asparagus officinalis）和綠竹（Dendrocalamopsis oldhami）等植物中SEP3基因的表達(dá)和相關(guān)功能[6-10]。

鐵皮石斛是蘭科石斛屬多年生草本植物，其不僅僅具有很高的藥用價(jià)值，同時(shí)還具有一定的觀賞價(jià)值，然而由于鐵皮石斛繁殖難、種植難、品種單一，野生資源因過(guò)度采挖而逐漸枯竭，市場(chǎng)品質(zhì)良莠不齊，加上育種目標(biāo)不明確、育種技術(shù)研究滯后等，導(dǎo)致鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢[11]。因此，對(duì)培育鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)新品種具有重大意義。

目前對(duì)與鐵皮石斛的研究主要集中于其藥理分析、快繁體系等方面，而有關(guān)花型發(fā)育方面的研究幾乎沒(méi)有。本研究通過(guò)對(duì)鐵皮石斛SEP3基因的生物信息學(xué)分析及利用 CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建出鐵皮石斛的SEP3敲除載體并進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，以期為進(jìn)一步研究SEP3基因在鐵皮石斛花朵發(fā)育中的功能及創(chuàng)造優(yōu)質(zhì)品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù) 鐵皮石斛DoSEP3基因序列來(lái)源于鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組NR注釋中的SEP3基因，根據(jù)FPKM（Fragments per kilobase per million）值選擇了表達(dá)量較高的序列，基因比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)所需其他物種氨基酸序列來(lái)源于uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒 載體構(gòu)建所需的Cas9骨架載體Ubi-H及啟動(dòng)子質(zhì)粒pYLsgRNA-OsU6a、pYLsgRNA-OsU6-b和pYLsgRNA-OsU6c由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授惠贈(zèng)，實(shí)驗(yàn)所用的大腸桿菌為TOP10，農(nóng)桿菌為EHA105。

1.1.3 植物及試劑 實(shí)驗(yàn)用于轉(zhuǎn)化的鐵皮石斛為種子萌發(fā)所得的鐵皮石斛原球莖。T5 Direct PCR Kit直接PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自擎科生物公司。

1.2 方法

1.2.1DoSEP3蛋白生物信息學(xué)分析 核苷酸翻譯使用DNAMAN軟件，采用Clustalx，MEGA6.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，利用ProtParam在線工具對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，利用SOPMA在線工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用Swiss-model在線工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用TMHMM在線工具進(jìn)行跨膜區(qū)域分析，利用PSORT Prediction在線工具預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。

1.2.2 鐵皮石斛SEP3基因敲除載體構(gòu)建 使用在線軟件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)進(jìn)行靶點(diǎn)設(shè)計(jì)[12]，并依據(jù)設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了3個(gè)sgRNA表達(dá)盒引物（表1），作為載體構(gòu)建方法依據(jù)[13]。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.3 遺傳轉(zhuǎn)化鐵皮石斛原球莖及陽(yáng)性原球莖的檢測(cè) 將構(gòu)建好的敲除載體熱激轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌，參照前人利用農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化鐵皮石斛的方法[17]，經(jīng)過(guò)抗性篩選后，切取小塊原球莖并利用特異性引物cas-f/cas-r(表1)進(jìn)行直接PCR驗(yàn)證獲得轉(zhuǎn)基因鐵皮石斛陽(yáng)性原球莖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DoSEP3基因的核苷酸序列及其編碼蛋白氨基酸序列

鐵皮石斛DoSEP3基因CDS序列長(zhǎng)度為354 bp，使用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)編碼117個(gè)氨基酸（圖1）。

圖1 鐵皮石斛DoSEP3基因的核苷酸序列及其編碼蛋白氨基酸序列Figure 1 Nucleotide sequence of Dendrobium officinale DoSEP3 gene and its encoded protein amino acid sequence

2.2 DoSEP3蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam分析結(jié)果顯示，其分子式為C 599 H 978 N178 O 160 S7。相對(duì)分子質(zhì)量為13 457.87 Da，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為60.53，而不穩(wěn)定系數(shù)小于40為穩(wěn)定蛋白，所以該蛋白為不穩(wěn)定蛋白，理論等電點(diǎn)為10.04，帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp + Glu）為12，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg +Lys）為23，脂肪指數(shù)為 94.10，親水性的平均值為—0.121，屬于親水蛋白。

2.3 DoSEP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

利用SOPMA在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖2），其中α-螺旋結(jié)構(gòu)占50.05%，延伸鏈占20.28%，β-轉(zhuǎn)角占11.89%，無(wú)規(guī)則卷曲占17.78%，其中大部分氨基酸處于α-螺旋結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)之上，利用Swiss-model預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（圖3），其GMQE值為0.22，QMEAN值為–1.05，零附近的QMEAN值表明模型結(jié)構(gòu)與相似大小的實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)之間具有良好的一致性。分?jǐn)?shù)為–4.0或以下表示模型的質(zhì)量較低[14]。

圖2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Figure 2 Predicted map of the protein secondary structure

圖3 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型Figure 3 Tertiary structure model of the protein

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及多序列比對(duì)

利用Clustalx，MEGA6.0軟件構(gòu)建簡(jiǎn)單系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），可以看出DoSEP3與同為蘭科石斛屬的金釵石斛的親緣關(guān)系最近。然后再取親緣關(guān)系較近的幾個(gè)物種進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)（圖5），藍(lán)色較多的部分占比較大，由此可以看出氨基酸序列的一致性和相似性較高。

圖4 DoSEP3蛋白與其他物種SEP3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Figure 4 DoSEP3 evolutionary tree analysis protein systems in other species

圖5 DoSEP3與其他物種SEP3氨基酸序列比對(duì)Figure 5 DoSEP3 alignment of amino acid sequences with SEP3 from other species

2.5 DoSEP3亞細(xì)胞定位，跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

利用TMHMM在線進(jìn)行跨膜區(qū)域分析（圖6），可以看出該蛋白具有一個(gè)跨膜區(qū)，利用PSORT Prediction在線預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核定位得分較高，說(shuō)明該蛋白作用可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞核。

圖6 DoSEP3跨膜區(qū)域分析Figure 6 DoSEP3 transmembrane region analysis

2.6 DoSEP3基因敲除載體構(gòu)建

利用獲得第一輪PCR的產(chǎn)物（圖7），再用第一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR組裝，獲得預(yù)期大小的3個(gè)sgRNA表達(dá)盒(圖8)；采用金門克隆法將多個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)連接到骨架載體上，導(dǎo)入大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，使用菌落PCR進(jìn)行陽(yáng)性菌落篩選（圖9）。隨后平板劃線，挑菌搖菌可參考之前生物信息學(xué)分析中的半衰期，提取質(zhì)粒，并用載體上的引物SP-L1和SP-R進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明構(gòu)建的靶位點(diǎn)sgRNA及啟動(dòng)子均在載體上。由此說(shuō)明SEP3基因的敲除載體構(gòu)建完成，可用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究。

圖7 第一輪PCR產(chǎn)物Figure 7 The first round PCR product

圖8 第二輪PCR產(chǎn)物Figure 8 The second round PCR product

圖9 大腸桿菌菌落PCR產(chǎn)物Figure 9 Escherichia coli colony PCR product

2.7 陽(yáng)性鐵皮石斛原球莖的鑒定

選擇8顆經(jīng)過(guò)抗性篩選后的原球莖切取小塊后，使用載體上的特異性引物，利用直接PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行PCR陽(yáng)性檢測(cè)(圖10)。編號(hào)1、3、4、5和6為陽(yáng)性原球莖。

圖10 特異性引物PCR產(chǎn)物Figure 10 PCR product using specific primers

3 討論與結(jié)論

多年來(lái)，研究者們對(duì)于SEP類基因的研究主要集中于擬南芥、水稻等經(jīng)典植物上，而對(duì)于石斛蘭SEP類基因的研究報(bào)道較少。通過(guò)生物信息學(xué)分析，可以預(yù)測(cè)SEP類基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的作用原理，預(yù)測(cè)SEP類基因的進(jìn)化機(jī)制，由此可以減輕試驗(yàn)的工作量，也增強(qiáng)了試驗(yàn)的目的性?；谙到y(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，可以通過(guò)已知基因功能的植物去推測(cè)同一分支不同植物相同基因的功能。已知SEP類基因在植物花器官的分化和發(fā)育中起著非常重要的作用。前人的研究也表明SEP3基因在花器官中的表達(dá)量遠(yuǎn)大于其在莖、葉中的表達(dá)[15]。SEP3基因在金釵石斛春化過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，可能與成花轉(zhuǎn)變有關(guān)蛋白的抑制和后續(xù)促進(jìn)花器官生長(zhǎng)有關(guān)[8]，SEP3可能通過(guò)與開(kāi)花促進(jìn)因子OC1發(fā)生相互作用而對(duì)成花轉(zhuǎn)變過(guò)程進(jìn)行調(diào)控[16]。由此可以推測(cè)，SEP3基因也作用于鐵皮石斛的花器官發(fā)育過(guò)程，而SEP3基因作為MADS-box家族中參與花開(kāi)調(diào)控基因的一員，對(duì)其展開(kāi)研究有助于更好地了解其調(diào)控機(jī)理。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是最新的第3代基因編輯技術(shù)，已廣泛地運(yùn)用于細(xì)菌和動(dòng)物中。隨著技術(shù)的不斷成熟，關(guān)于該系統(tǒng)在植物中的驗(yàn)證和應(yīng)用的報(bào)道很多，但在蘭科植物中的應(yīng)用較少，蘭科植物是被子植物第二大科，擁有達(dá)爾文花之稱，是研究物種進(jìn)化的最好材料[17]。

本研究通過(guò)對(duì)鐵皮石斛SEP3基因的生物信息學(xué)分析，了解了DoSEP3蛋白的理化性質(zhì)，確定了該蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)質(zhì)量也較高，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和氨基酸序列的比對(duì)，可以推測(cè)DoSEP3的作用與同為蘭科石斛屬的金釵石斛中SEP3基因作用相似，DoSEP3主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核，且具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，推測(cè)可能通過(guò)細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與花器官發(fā)育。利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建出了敲除載體并進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，且成功將載體導(dǎo)入原球莖中，獲得了鐵皮石斛陽(yáng)性原球莖，這為了解MADS-box家族中SEP類基因在花發(fā)育過(guò)程中的所起的作用奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究SEP3基因在鐵皮石斛花器官發(fā)育中的功能及創(chuàng)造優(yōu)質(zhì)品種提供幫助。