向妙蓮　徐昭煥　馬建　陳明

【摘要】為增強大學(xué)生的創(chuàng)新意識和科研素養(yǎng)，探討綜合性創(chuàng)新實驗教學(xué)在園藝植物病理學(xué)實驗課程中的應(yīng)用，設(shè)計了“茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)梨果實抗青霉病的效應(yīng)與機理”實驗，包括MeJA對青霉病菌（Penicillium italicum）的抑菌活性、誘導(dǎo)梨果實抗青霉病效應(yīng)及對梨果實病程相關(guān)蛋白幾丁質(zhì)酶（Chitinase，CHI）活性和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，GLU）活性的影響。實踐表明，基于植物病理學(xué)基礎(chǔ)理論的綜合性創(chuàng)新實驗有助于學(xué)生掌握寄主-病原互作的基本原理和實驗技能，提高學(xué)生實驗方案設(shè)計、實驗研究組織和實驗結(jié)果分析的能力，激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新精神和科學(xué)意識。

【關(guān)鍵詞】科研成果? 園藝植物病理學(xué)? 綜合實驗? 創(chuàng)新能力

【基金項目】國家自然科學(xué)基金（31360466）;江西省高校省級教改立項項目（JXJG-18-3-30）; 江西省高校省級教改立項項目（JXJG-19-3-9）。

【中圖分類號】G640 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-3089（2021）07-0189-02

園藝植物病理學(xué)實驗教學(xué)是與園藝植物病理學(xué)理論課程緊密相關(guān)的一個重要教學(xué)環(huán)節(jié)，當(dāng)前傳統(tǒng)的驗證性實驗教學(xué)模式限制了創(chuàng)新性園藝人才的培養(yǎng)。因此，增加綜合性創(chuàng)新實驗課程占比，以適應(yīng)新農(nóng)科背景下實驗教學(xué)的需要，是目前實驗教學(xué)改革創(chuàng)新中值得考慮和重視的問題。高?？蒲谐晒瓤纱龠M生產(chǎn)發(fā)展，又可豐富教學(xué)資源，有效依托科研優(yōu)勢提升實驗教學(xué)水平，將科研成果轉(zhuǎn)化為實驗教學(xué)的創(chuàng)新模式?？蒲信c教學(xué)相互轉(zhuǎn)化、相互促進，科研反哺教學(xué)，科學(xué)研究思維方法和實驗操作技能融于一體，具有綜合性、前沿性和應(yīng)用性的特點，旨在提高學(xué)生的探索精神，鍛煉學(xué)生的創(chuàng)新思維以及運用理論知識和實驗技能解決具體問題的能力，是目前實驗教學(xué)改革研究的熱點[1-4]。

果蔬采后病害是制約園藝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸性障礙，目前主要通過化學(xué)藥劑控制該病害。為了確保果蔬產(chǎn)品生態(tài)、安全，綠色植保防控技術(shù)的應(yīng)用及推廣已迫在眉睫 [5-6]。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）作為植物抗病反應(yīng)的重要信號分子作用于植物受體細(xì)胞進而參與防御信號的傳導(dǎo)，調(diào)控植物免疫系統(tǒng)，增強植物抗病性[7-8]。幾丁質(zhì)酶（CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（GLU）為兩類重要的病程相關(guān)蛋白，與果蔬采后抗病密切相關(guān)[9-11]。MeJA等外源物質(zhì)處理可誘導(dǎo)果蔬CHI和GLU活性升高，從而減緩果蔬采后病害的發(fā)生[12-13]。

1.綜合性創(chuàng)新實驗特色

園藝植物病理學(xué)綜合性創(chuàng)新實驗基于果蔬采后貯藏保鮮領(lǐng)域研究熱點，依托江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)及質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院等最新研究成果，將茉莉酸甲酯（MeJA）等外源物質(zhì)誘導(dǎo)果實抗采后病害研究中取得的部分成果轉(zhuǎn)化為園藝植物病理學(xué)實驗的一個教學(xué)內(nèi)容，構(gòu)建具有綜合植物病理學(xué)知識、強化實驗技能訓(xùn)練和將基礎(chǔ)知識運用于科技前沿研究特點的實驗教學(xué)模式[14-15]。綜合性創(chuàng)新實驗通過強調(diào)科學(xué)問題熱點引領(lǐng)和學(xué)生自主設(shè)計，學(xué)生通過比較MeJA誘導(dǎo)梨果實抗青霉病的效應(yīng)及對青霉病菌（Penicillium expansum）的抑菌作用差異，逐步將科研成果引入到實驗教學(xué)中，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)專業(yè)知識興趣，培養(yǎng)創(chuàng)新思維和創(chuàng)新能力，為學(xué)生科研實驗和畢業(yè)設(shè)計奠定基礎(chǔ)。

2.綜合性創(chuàng)新實驗教學(xué)設(shè)計

2.1實驗材料

試驗用果：“翠冠”梨果實采自江西省峽江縣金坪鄉(xiāng)果園，于當(dāng)日采摘后放置于實驗室，挑選無病蟲害、大小統(tǒng)一的果實，放置24h充分散去田間熱后用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡果實1～2min消毒后用自來水沖洗干凈，室溫下晾干后保鮮袋單果套袋，入庫備用（冷庫溫度4～5℃）。

供試菌株：擴展青霉（P.expansum），由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供，-80℃保存，試驗前培養(yǎng)5～7d，用無菌水洗脫孢子，經(jīng)無菌脫脂棉過濾后用血球計數(shù)板計數(shù)，配置濃度為1.0×106 spores /mL孢子懸浮液，備用。

供試試劑：茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA），購自美國Sigma公司，先使用微量0.1% Tween80和少許乙醇混合均勻，后加無菌水配置為濃度1000 μL/L的MeJA溶液;異羥肟酸（Salicyhydroxamic acid，SHAM，茉莉酸生物合成合成抑制劑），購自美國Sigma公司，先溶于95%乙醇，再用含0.1% Tween 80的無菌水配置成1000 μL/LSHAM備用;CHI活性和GLU活性測定采用試劑盒（Solarbio，北京，中國），乙酸-乙酸鈉緩沖液（含EDTA、β-巰基乙醇）。

2.2 實驗方法

2.2.1 MeJA對P. expansum的抑菌活性

采用牛津杯法測定MeJA對P.expansum的抑制作用。取6 mL供試菌株孢子懸浮液加入54mL溫度約45℃左右PDA培養(yǎng)基中，搖勻，倒入無菌培養(yǎng)皿制成含青霉菌平板。待平板凝固后，在培養(yǎng)皿中心放置無菌牛津杯（直徑為7mm），取100μL濃度為10μmol/L、經(jīng)0.22μm細(xì)菌微孔濾膜過濾的MeJA溶液注入牛津杯中，每個處理重復(fù)3次，置25±1℃恒溫培養(yǎng)箱逐日觀察記錄抑菌圈大小。對照組用等量含0.1% Tween80無菌水。

2.2.2 MeJA誘導(dǎo)梨果實抗青霉病效應(yīng)

將待處理果實置于熏蒸盒（體積6L）內(nèi)，中央放置滅菌濾紙，將適量 MeJA滴在滅菌濾紙上使盒內(nèi)MeJA濃度達(dá)到10μmol/L，迅速密封塑料盒，對照組用含0.1%Tween80無菌水，另用100μmol/L的SHAM溶液噴施在果實表面，于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)36h，在果實孔內(nèi)注入20μL1.0×106 spores/mL青霉孢子懸浮液。每處理10個果，3次重復(fù)。以上處理后逐日觀察梨果實發(fā)病情況，采用十字交叉法測量病斑直徑，按以下公式計算誘導(dǎo)效果：誘導(dǎo)效果=（對照病斑直徑-處理組病斑直徑）/對照病斑直徑×100%。

2.2.3 MeJ處理對梨果實CHI和GLU活性的影響

試驗設(shè)5組處理：CK處理組;10、100和1000 μmol/L MeJA處理組;100 μmol/L SHAM處理組。其他方法同2.2.2，每組處理10個果，每組3次重復(fù)。接種后第96 h取病健交界處果肉，液氮迅速冷凍置于-80℃超低溫箱保存，待用。根據(jù)曹建康等方法稍微改進，提取CHI和GLU粗酶液，采用試劑盒（Solarbio，北京，中國）測定其活性。

2.2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel2003和SPSS16.0 統(tǒng)計分析，用單因素方差比較統(tǒng)計各處理平均值的差異，Duncan 氏新復(fù)極差法（Duncans new multiple range test）分析各處理間的差異顯著性。

3.綜合性創(chuàng)新實驗結(jié)果分析

3.1 MeJA對P. expansum的抑菌活性

培養(yǎng)5 d后MeJA對青霉病菌的抑制作用，與對照相比，濃度為10 μmol/L MeJA的牛津杯周圍無抑菌圈。通過抑菌活性實驗，學(xué)生掌握了PDA培養(yǎng)基的配制和牛津杯法測定MeJA對P. expansum的抑菌方法，逐步熟悉園藝植物病理學(xué)研究的實驗技能。

3.2 MeJA誘導(dǎo)梨果實抗青霉病的效應(yīng)

不同濃度MeJA處理對梨果實抗青霉病誘導(dǎo)效應(yīng)因濃度不同而各異。10和100μmol/L MeJA處理后誘導(dǎo)效應(yīng)分別為3.45%和14.59%（P <0.05）。

3.3 MeJA處理對梨果實病程相關(guān)蛋白活性的影響

10和100 μmol/L濃度MeJA處理組均顯著提高了梨果實CHI活性，分別比對照處理提高了11.02%和45.24%。1000 μmol/L MeJA處理組則抑制了CHI活性，為對照組的85.17%（P <0.05）。100 μmol/L MeJA處理組GLU活性最高，為對照組的1.46倍，而10和100 μmol/L處理之間無顯著性差異（P <0.05）。

4 .綜合性創(chuàng)新實驗教學(xué)設(shè)計

依托外源物質(zhì)誘導(dǎo)果實抗病的研究熱點問題，構(gòu)建MeJA誘導(dǎo)梨果實抗青霉病的綜合性創(chuàng)新實驗課，主要教學(xué)設(shè)計如下：第一，課前準(zhǔn)備——指導(dǎo)教師引導(dǎo)學(xué)生逐步熟悉實驗課程的教學(xué)目標(biāo)和主要內(nèi)容后，每組4～5人查找果實采后誘導(dǎo)抗病相關(guān)文獻，以組為單位撰寫可行性實驗計劃，初擬創(chuàng)新性實驗設(shè)計和方案，指導(dǎo)教師提出修改意見和建議;第二，課中實施——課時總計8學(xué)時，其中2學(xué)時準(zhǔn)備實驗材料（PDA、病原菌、果實預(yù)處理），3學(xué)時完成MeJA-病原菌-果實三者互作處理（接種、取樣），3學(xué)時（病情統(tǒng)計、GLU和CHI測定，結(jié)果分析），各組同學(xué)在實驗指導(dǎo)老師協(xié)助下不斷完善實驗方案，學(xué)習(xí)使用儀器設(shè)備和統(tǒng)計軟件;第三，課后討論：各組分析討論后小結(jié)實驗結(jié)果，分析實驗成功和失敗原因，如病原菌污染、接種不發(fā)病以及酶活性單位差異等問題，最后指導(dǎo)教師總結(jié)分析各組實驗結(jié)果，學(xué)生結(jié)合資料查閱，比較MeJA誘導(dǎo)梨果實抗青霉病的效應(yīng)和病程相關(guān)蛋白活性差異，分析MeJA誘導(dǎo)抗病的可能途徑，撰寫實驗研究報告。

參考文獻：

[1]賈永霞.創(chuàng)新性實驗教學(xué)的探究與實踐[J].實驗室研究與探索，2018，37（12）：206-208.

[2]賈智偉，賀科學(xué)，黃亞飛.大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃的實施實踐與思考[J].教育現(xiàn)代化，2019（63）：65-68.

[3]蔣敏，李會，史勁松.基于科研成果的藥理學(xué)教學(xué)實驗探索[J].實驗室研究與探索，2020，39（1）：217-220.

[4]王益林，文輝忠，舒馨，等.鐵含量測定的研究型教學(xué)實驗設(shè)計與實踐[J].實驗室研究與探索，2020，39（3）：194-197.

[5]張維一，畢陽.果蔬采后病害與控制[M].農(nóng)業(yè)出版社， 1996.

[6]田世平，產(chǎn)祝龍.誘導(dǎo)抗性在果蔬采后病害防治中的研究與應(yīng)用[J].植物病理學(xué)報，2004，34（5）：385-394.

[7]薛仁鎬， 金圣愛. 茉莉酸甲酯：一種重要的植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[J].生物技術(shù)通訊，2006，17（6）：985-988.

[8]崔席席，李富軍，張新華，等.茉莉酸甲酯調(diào)控果蔬采后品質(zhì)的機制及應(yīng)用研究進展[J].食品科學(xué)，2019，40（13）：304-311.

[9]陳三鳳，李季倫.幾丁質(zhì)酶研究歷史和發(fā)展前景[J]. 微生物學(xué)通報，1993，20（3）：156-160.

[10]邢全華，王斌.植物葡聚糖酶基因抗病作用的研究進展[J].遺傳，2002，24（6）：715-720.

[11]李春娟，單世華，許婷婷，等.幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶基因研究進展[J]. 生物技術(shù)通訊， 2004，15（5）：502-505.

[12]王雷.不同激發(fā)子處理對甜櫻桃果實采后青霉病的抑制作用及其機理研究[D].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[13]王英珍，程瑞，張紹鈴，等.采前茉莉酸甲酯（MeJA）處理對梨果實抗病性的影響[J].果樹學(xué)報，2016，33（6）：694-700.

[14]徐小彪， 曲雪艷， 鄒菊花，等. 高等農(nóng)業(yè)院校植物生產(chǎn)類本科專業(yè)實驗教學(xué)改革的探討[J].高等農(nóng)業(yè)教育，2010（7）：67-69.

[15]朱昌蘭， 李保同， 徐小彪，等. 植物生產(chǎn)類專業(yè)創(chuàng)新型人才培養(yǎng)模式探索——基于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心的改革實踐[J]. 中國農(nóng)業(yè)教育， 2012（3）：71-74.

作者簡介：

向妙蓮（1977年10月-），女，苗族，湖南綏寧人，博士，副教授，研究方向：植物寄主與病原物互作。

陳明（1979年8月-），男，漢族，江西武寧人，博士，副教授，研究方向：果實采后生物學(xué)。