張瑞華，高善頌，李煥發(fā)，張丹萍，竇心怡，韓先杰

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109）

豬巴氏桿菌病又被稱為豬肺疫［1］，在遼寧、青海、四川、上海、湖南、湖北等地常有發(fā)生，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。在對該病的診斷治療和防控過程中，豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定和血清型鑒定是不可或缺的一部分。多殺性巴氏桿菌通常存在于各種動物的口腔和咽部粘膜中，當(dāng)各種原因引起動物應(yīng)激反應(yīng)或者導(dǎo)致動物機(jī)體抵抗力降低時，該菌會迅速生長繁殖引起動物患病，并發(fā)生內(nèi)源性感染［2］，還可與豬傳染性胸膜肺炎、豬偽狂犬病、豬喘氣病、豬鏈球菌病等發(fā)生繼發(fā)感染或混合感染［3］。

2019年1月某規(guī)?；阖i場有5頭病死小香豬送檢，為確定病原并為其用藥提供參考，本研究從送檢病例中分離到3株細(xì)菌，經(jīng)鑒定均為A型多殺性巴氏桿菌，并對其進(jìn)行了藥物敏感性試驗等。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細(xì)菌來源 采集于青島某豬場病死香豬的肺臟。

1.1.2 主要試劑 PCR試劑等購自青島紫恩生物科技有限公司；藥敏紙片購自青島科盛源科技發(fā)展有限公司；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、綿羊血瓊脂培養(yǎng)基、生化試劑等購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌的分離及形態(tài)觀察 將病死豬肺臟置于超凈工作臺中，使用無菌接種環(huán)蘸取細(xì)支氣管中分泌物，劃線接種于綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上，至恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，觀察生長情況。培養(yǎng)結(jié)束后挑取單個菌落至載玻片上，對其進(jìn)行革蘭氏染色并使用油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.2 生化試驗 挑取分離菌接種到腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，取培養(yǎng)完成的菌液離心洗滌后接種到細(xì)菌微量發(fā)酵管中，37℃恒溫箱中培養(yǎng)16～22 h，培養(yǎng)完成后查看并記錄生化反應(yīng)結(jié)果。

1.2.3 16S rRNA基因的擴(kuò)增 使用煮沸法提取細(xì)菌DNA，用于擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因序列的通用引物［4］見表1，由青島派森諾基因生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系（25μL）:2×TaqMaster Mix 12.5μL，上下游引物各1.5μL，DNA模板2.5μL，去離子水7.0μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，53℃退火15 s，72℃延伸2 min，共34個循環(huán)；72℃延伸7 min；10℃終止反應(yīng)。

表1 擴(kuò)增16S rRNA基因通用引物序列

1.2.4 PCR產(chǎn)物測序 由青島派森諾基因科技有限公司對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。利用NCBI的BLAST工具進(jìn)行序列的同源性比對，利用MEGA 6軟件進(jìn)行進(jìn)化分析。

1.2.5 細(xì)菌血清型鑒定 5對鑒定血清型的引物序列［5］見表2。PCR擴(kuò)增體系（25μL）:上下游引物各1.0μL，DNA模板2.0μL，2×TaqMaster Mix 12.5μL，滅菌去離子水8.5μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性3 min；94℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸75 s，共32個循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃結(jié)束反應(yīng)并保存。

表2 鑒定血清型的引物序列

1.2.6 動物試驗 挑取單菌落接種到腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，封上封口膜后放入37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～22 h，并計算活菌數(shù)。設(shè)置濃度分別為104、105、106cfu/mL攻毒組和對照組，每處理隨機(jī)選取8只健康小白鼠，對照組不做任何處理，攻毒組腹腔注射菌液均為0.3 mL。連續(xù)3 d觀察死亡情況，采用改良寇氏法計算LD50值。

1.2.7 藥敏試驗 藥敏試驗根據(jù)Kirby－Bauer法進(jìn)行，按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［6］和青島科盛源科技發(fā)展有限公司提供的紙片法藥敏試驗指導(dǎo)進(jìn)行藥物敏感性判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離與形態(tài)觀察

從肺臟中共分離出3株菌，在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)過37℃培養(yǎng)24 h，菌落呈灰白色、濕潤、半透明的露珠狀，不溶血（圖1）。革蘭氏染色呈陰性，形態(tài)為兩端鈍圓的短桿菌（圖2）。將本試驗分離菌分別命名為SD－PM07、SD－PM08和SD－PM09。

圖1 綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上分離菌菌落

圖2 分離菌菌體形態(tài)（1 000×）

2.2 生化試驗結(jié)果

分離菌SD－PM07、SD－PM08、SD－PM09的生化試驗結(jié)果一致（表3），與巴氏桿菌的生化特征相符［7］。

表3 生化試驗結(jié)果

2.3 細(xì)菌16S rRNA基因的擴(kuò)增

擴(kuò)增結(jié)果（圖3）顯示，3株分離菌均擴(kuò)增出大小約為1 500 bp的目的DNA，與預(yù)期大小相符。

圖3 分離菌16S rRNA基因擴(kuò)增結(jié)果

2.4 基因測序分析

同源性比對結(jié)果顯示，分離菌與多殺性巴氏桿菌（GenBank序列號CP048402）同源性為99.9%，結(jié)合形態(tài)觀察和生化試驗結(jié)果，可確定分離菌株為多殺性巴氏桿菌。由序列進(jìn)化樹（圖4）可知，3株分離菌單獨(dú)處在小的分支上，其遺傳進(jìn)化來源還需進(jìn)一步研究。

圖4 分離菌株基于16S rRNA基因序列的進(jìn)化樹分析

2.5 血清型鑒定

莢膜血清型鑒定結(jié)果（圖5）表明，3株分離菌均是A型血清型。

圖5 分離菌株莢膜血清型鑒定

2.6 致病性試驗結(jié)果

本試驗分離菌株的LD50為1.8×105cfu/mL。對死亡小鼠進(jìn)行病理解剖發(fā)現(xiàn)其肝腫大、有壞死點(diǎn)，肺充血、有出血點(diǎn)，小腸壁薄、有出血點(diǎn)，大腸壁上有出血點(diǎn)。切取部分發(fā)病組織進(jìn)行涂片，革蘭氏染色后使用油鏡觀察，視野中呈現(xiàn)大量革蘭氏陰性短桿菌。

2.7 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果（表4）表明，分離菌對頭孢他啶、慶大霉素、頭孢哌酮、鏈霉素、左氧氟沙星、卡那霉素、頭孢曲松、哌拉西林、氨芐西林、頭孢噻肟敏感；對強(qiáng)力霉素中度敏感；對氧氟沙星耐藥。

表4 分離菌藥物敏感試驗結(jié)果

3 討論與結(jié)論

經(jīng)生化試驗、16S rRNA基因序列分析及血清型鑒定，3株分離菌均為多殺性巴氏桿菌A型。藥敏試驗結(jié)果顯示，分離菌株主要對β內(nèi)酰胺類抗生素敏感。

經(jīng)分析，該豬場主要由于飼養(yǎng)環(huán)境差導(dǎo)致細(xì)菌感染。豬多殺性巴氏桿菌可通過豬飼料、飲水以及空氣等進(jìn)入機(jī)體進(jìn)行感染［8］；飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境衛(wèi)生差導(dǎo)致動物機(jī)體抵抗力下降，從而更容易使病原菌侵入動物血液引發(fā)感染、死亡。因此，日常需要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好圈舍衛(wèi)生以及消毒工作等，以防止病原體入侵。