畢宜慧，張鑫宇，李 杰，孫亦如，王浩哲，付東勇，尹紹武

（南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省特色水產(chǎn)育種與綠色高效養(yǎng)殖技術(shù)工程研究中心，南京 210023）

暗紋東方鲀（Takifugufasciatus）是隸屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii）鲀形目（Tetraodontiformes）鲀科（Tetraodontidae）東方鲀屬的江海洄游性魚類，主要分布于太平洋西岸的中國近海區(qū)域及長江中下游地區(qū)、朝鮮半島和日本，在民間多被稱為“河豚”。其肉質(zhì)鮮嫩，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，被譽(yù)為“魚中之王”，是長江下游重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一［1－3］。人工養(yǎng)殖的暗紋東方鲀營養(yǎng)豐富，食味極鮮，雄性的精巢更是因?yàn)闊o毒與美味，被民間譽(yù)為“西施乳”，帶有“西施乳”的雄魚售價(jià)接近雌魚的兩倍［4－6］。此外，野生河鲀含有的河豚毒素（TTX）是一種生物堿，通過阻斷內(nèi)向鈉電流引起生物體的中毒反應(yīng)，非常致命，但低濃度時(shí)也可用作藥物治療神經(jīng)疾病，目前已被開發(fā)用于臨床使用［7］。TTX產(chǎn)量極低，價(jià)格極其昂貴，含量最高處為雌性河鲀卵巢［8］。因暗紋東方鲀雌雄個(gè)體各有特點(diǎn)，雄性主供食用，雌性（卵巢）主供藥用，故應(yīng)根據(jù)用途不同將雌雄個(gè)體分開喂養(yǎng)，同時(shí)人工繁育時(shí)，需在人工授精前按性別設(shè)定劑量催產(chǎn)，受精后雌雄分池護(hù)理親魚?？梢姡导y東方鲀個(gè)體的性別區(qū)分在生產(chǎn)實(shí)踐環(huán)節(jié)尤為重要。

在魚類人工繁殖過程中，性別判定是進(jìn)行性別定向控制、選育及繁殖的重要基礎(chǔ)［9］。除了根據(jù)魚類第一性征即精巢與卵巢的區(qū)別，也可利用魚類的第二性征（副性征）進(jìn)行雌雄判別。僅有部分魚類的第二性征具有明顯的差異，例如稀有鮈鯽（Gobiocyprisrarus）的雄魚胸、腹鰭較雌魚更長且鰓蓋、胸鰭上有細(xì)小的棘狀珠星［10］；半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）等鰈形目魚類，其雌性生長速度和規(guī)格均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于雄性［11］；中華鳑鲏（Rhodeussinensis）繁殖期間雄魚體色艷麗，呈金屬藍(lán)色，而雌魚則色澤黯淡［12］。但有些魚類如鱘科［13］、鲀科［14］等，其雌雄個(gè)體間第二性征并無明顯的差異，僅憑肉眼無法鑒別，只能根據(jù)第一性征進(jìn)行判別，此法需剖殺活體，造成樣本浪費(fèi)，且不適用于幼齡魚和珍稀瀕危物種。因此，迫切需要開發(fā)其他性別鑒定方法。

分子標(biāo)記技術(shù)已被證明是進(jìn)行魚類性別特異性遺傳標(biāo)記以及性別控制的有效工具［15－16］，但是存在標(biāo)記定位困難、耗時(shí)久、成本高等缺點(diǎn)［17－19］。另外，超聲波技術(shù)在條紋鱸（Morone saxatilis）、歐 洲 大 比 目 魚（Hippoglossus hippoglossus）和大西洋鱈（Cadusmorhua）等魚類性別鑒定中也發(fā)揮了重要作用［20］，但由于其技術(shù)的局限性，在實(shí)際生產(chǎn)和野外工作中不能快速簡便區(qū)分雌雄，實(shí)用性有局限。而目前利用大量魚類樣本通過測定其形態(tài)和框架指標(biāo)并篩選出特殊指標(biāo)來進(jìn)行性別判定則是一種較為簡單實(shí)用的方法，比如武兆文等［9］基于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對509尾雜交黃顙魚（Pelteobagrusfulvidraco）“黃優(yōu)1號”中的2齡群體和3齡群體分別進(jìn)行雌雄判別，準(zhǔn)確率分別為87.0%和84.2%；吳波等［21］依據(jù)所建立的金錢魚（Scatophagusargus）雌雄判別方程的判別準(zhǔn)確率為85.96%；郭弘藝等［22］建立的雌雄判別方程對153尾銀色鰻（Anguilla japonica）的識別準(zhǔn)確率達(dá)到89.3%。由此可見，此法利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，無需復(fù)雜儀器和技術(shù)手段，相較于分子標(biāo)記技術(shù)和超聲波技術(shù)具有快速、高效、成本低等優(yōu)點(diǎn)，是一種行之有效的方法。

暗紋東方鲀雌雄個(gè)體外形差異較小，且生長規(guī)律相似，不易辨別，實(shí)際生產(chǎn)中需要有豐富操作經(jīng)驗(yàn)的人員通過撫摸輕壓已發(fā)育成熟個(gè)體（3～4齡）的性腺進(jìn)行區(qū)分，導(dǎo)致區(qū)分困難，易形成技術(shù)壟斷，無經(jīng)驗(yàn)的人員操作時(shí)甚至有可能對魚體內(nèi)臟造成物理損傷。目前已公開的利用引物擴(kuò)增鑒定東方鲀幼魚性別的方法盡管精確度高，但是需要提取魚體的組織，不可避免地會對魚類造成物理損傷［23］。而DNA提取，引物擴(kuò)增和測序過程將會耗費(fèi)大量時(shí)間，不利于即時(shí)標(biāo)記性別，成本也過高。面對不足1齡的個(gè)體時(shí)，從外觀和撫摸都無法判斷其雌雄，若通過解剖觀察性腺以分辨雌雄的話，會導(dǎo)致個(gè)體死亡，失去養(yǎng)殖和利用價(jià)值。因此，市場上亟需一種耗時(shí)短、方法簡單、成本低的東方鲀屬魚類性別鑒定方法。本研究利用暗紋東方鲀的形態(tài)指標(biāo)篩選出特定指標(biāo)進(jìn)行性別判定，以期為今后暗紋東方鲀?nèi)斯ゐB(yǎng)殖及新品種培育過程中雌雄的判別提供參考方法和理論依據(jù)，也可為其他魚類的雌雄鑒定方法研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚均于2018年4月采自江蘇省江陰市申港三鮮養(yǎng)殖有限公司，共取實(shí)驗(yàn)用魚300尾，2～3月齡左右，剔除無法辨別雌雄的個(gè)體后最終得到296尾暗紋東方鲀的有效計(jì)量性狀。其體長范圍為74.90～124.10 mm，體質(zhì)量范圍為（11.752±8.320）～（56.948±8.320）g。通過解剖觀察其性腺特征確定性別，其中雌魚158尾，雄魚138尾。

1.2 數(shù)據(jù)測量

測量全部296尾暗紋東方鲀11項(xiàng)計(jì)量性狀，包括全長［full length，F(xiàn)L；（118.32±10.21）mm］、體長［body length，BL；（101.44±8.23）mm］、頭長［head length，HL；（36.43±3.27）mm］、軀干長［trunk length，TL，（33.07±3.48）mm］、尾 柄 長［caudal peduncle length，CPL；（20.32±2.16）mm］、尾柄高［caudal peduncle height，CPH；（9.00±1.10）mm］、體高［body height，BH；（21.50±2.78）mm］、體寬［body width，BW；（23.76±2.74）mm］、眼徑［eye diameter，ED；（5.66±0.44）mm］、眼間距［interorbital distance，ID；（19.19±1.90）mm］、體質(zhì)量［weight，W；（33.17±8.32）g］。長度測量采用游標(biāo)卡尺（±0.05 mm）（573～642 mm，±0.05 mm），質(zhì)量測量采用電子天平（JSC-T29-6，±0.001 g），各指標(biāo)測量方法見圖1。肥滿度（condition factor，CF）＝體質(zhì)量（g）／體長3（cm）×100%，體質(zhì)量精確至0.01 g，體長精確至0.01 cm。

圖1 暗紋東方鲀形態(tài)測量示意圖Fig.1 Schematic diagram of morphometrics of T.fasciatus

1.3 數(shù)據(jù)處理

為消除個(gè)體差異對數(shù)據(jù)的影響，將測得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及計(jì)算各性狀間的比值，共得到11項(xiàng)計(jì)量性狀［全長（FL）、體長（BL）、頭長（HL）、軀干長（TL）、尾柄長（CPL）、尾柄高（CPH）、體高（BH）、體寬（BW）、眼徑（ED）、眼間距（ID）、體質(zhì)量（W）］及11項(xiàng)比例性狀［肥滿度（CF）、全長／體長（FL／BL）、頭長／體長（HL／BL）、軀干長／體長（TL／BL）、尾柄長／體長（CPL／BL）、尾柄高／體長（CPH／BL）、尾柄長／尾柄高（CPL／CPH）、體高／體長（BH／BL）、體寬／體長（BW／BL）、眼徑／頭長（ED／HL）、眼間 距／頭 長（ID／HL）］。利 用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步統(tǒng)計(jì)和處理，利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行主成分分析和逐步判別分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗紋東方鲀主成分分析

為簡化暗紋東方鲀的外形特征，明確其雌雄形態(tài)特點(diǎn)，對暗紋東方鲀雌、雄個(gè)體的11項(xiàng)計(jì)量性狀和11項(xiàng)比例性狀進(jìn)行主成分分析（表1）。KMO和巴特利特球形先行檢驗(yàn)證明，296尾暗紋東方鲀KMO取樣適切性量數(shù)為0.644＞0.600，巴特利特球形檢驗(yàn)顯著性P＜0.01，表明各比例性狀間存在關(guān)聯(lián)，因子降維分析結(jié)果可靠?？偡讲罘治鲎罱K獲得4個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為72.31%，4個(gè)主成分及其包含的性狀和負(fù)荷量見表1。其中主成分Ⅰ的貢獻(xiàn)率為31.47%，包括全長（FL）、體長（BL）、頭長（HL）、軀干長（TL）、尾柄長（CPL）、尾柄高（CPH）、體高（BH）、體寬（BW）、眼間距（ID）、體質(zhì)量（W）10項(xiàng)計(jì)量性狀，反映了暗紋東方鲀的整體輪廓指標(biāo)；主成分Ⅱ的貢獻(xiàn)率為18.64%，包括體高（BH）、尾柄高／體長（CPH／BL）、尾柄長／尾柄高（CPL／CPH）、體高／體長（BH／BL）、體寬／體長（BW／BL），主要反映了暗紋東方鲀的整體及尾部的渾圓程度；主成分Ⅲ貢獻(xiàn)率為11.32%，包括頭長／體長（HL／BL）、眼徑／頭長（ED／HL）、眼間距／頭長（ID／HL），主要反映了暗紋東方鲀的頭部特征；主成分Ⅳ貢獻(xiàn)率為10.89%，包括肥滿度（CF）和尾柄長／體長（CPL／BL），主要反映了暗紋東方鲀的尾部特征。

表1 4個(gè)主成分貢獻(xiàn)率及各個(gè)指標(biāo)負(fù)荷量Tab.1 Contribution rate of four principal components and the load capacity of each index

根據(jù)主成分分析的結(jié)果，對主成分Ⅰ與主成分Ⅱ的雌雄個(gè)體主成分的得分做散點(diǎn)圖（圖2），從圖2中可以看出，圓形相較三角形更偏上方聚集，雌魚相較于雄魚在主成分Ⅱ的得分上更高一些。

2.2 暗紋東方鲀雌雄判別分析

對所采集的296尾暗紋東方鲀11項(xiàng)計(jì)量性狀及11項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化性狀進(jìn)行逐步判別分析，依據(jù)各變量對判別模型的貢獻(xiàn)大小逐步剔除不相關(guān)變量，最終共篩選出5個(gè)變量，分別為X1（眼徑，mm）、X2（肥滿度）、X3（頭長／體長）、X4（尾柄高／體長）、X5（體寬／體長）。這5個(gè)形態(tài)指標(biāo)反映了暗紋東方鲀雌雄個(gè)體在整體輪廓上的差異，根據(jù)篩選出的5個(gè)變量所建立的典型判別模型方程為：

判別函數(shù)的顯著性檢驗(yàn)顯示P＜0.01，表明判別函數(shù)達(dá)到極顯著水平。分別計(jì)算出雌雄個(gè)體的判別分?jǐn)?shù)值，得到暗紋東方鲀雌雄個(gè)體的頻布圖，表明該模型可以用于區(qū)分暗紋東方鲀的性別（圖3，圖4）。

圖3 暗紋東方鲀雌性個(gè)體判別分?jǐn)?shù)頻布Fig.3 Frequency distribution of discriminant score of female T.fasciatus

圖4 暗紋東方鲀雄性個(gè)體判別分?jǐn)?shù)頻布Fig.4 Frequency distribution of discriminant score of male T.fasciatus

根據(jù)所建立的判別方程，對所采集的296尾暗紋東方鲀進(jìn)行回判，將每尾個(gè)體的5個(gè)特征參數(shù)值帶入方程，分別計(jì)算F1和F2，如果F1＞F2，則該個(gè)體為雌性，反之則為雄性。經(jīng)驗(yàn)證，該判別方程的綜合判別準(zhǔn)確率達(dá)81.1%，其中雌性判別準(zhǔn)確率為84.2%，雄性判別準(zhǔn)確率為77.5%（表2）。

表2 暗紋東方鲀性別判別結(jié)果Tab.2 Discriminant results of sexual distinction of T.fasciatus

對用于建立判別函數(shù)的5個(gè)形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，5個(gè)形態(tài)指標(biāo)中只有尾柄高／體長和體寬／體長兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化性狀在暗紋東方鲀雌雄個(gè)體間呈現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01）（表3），表明雌性個(gè)體身體較寬、尾柄較高。

表3 特征性狀的t檢驗(yàn)及暗紋東方鲀雌雄形態(tài)差異Tab.3 t-test of characteristics and morphological differences between female and male T.fasciatus

3 討論

魚類在脊椎動物的演化過程中處于承上啟下的地位，是分布最廣泛、種類最豐富的脊椎動物類群，現(xiàn)存三萬多種，超過了其他脊椎動物的總和，同時(shí)魚類的性別鑒定也一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)［24］。魚類雌雄個(gè)體間存在生長差異的現(xiàn)象，例如鱖（Sinipercachuatsi）［25－26］、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）［27］和半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）［28］等，其雌雄個(gè)體間生長速度存在明顯差異。近年來，為有效區(qū)分魚類性別，多元統(tǒng)計(jì)分析方法被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)領(lǐng)域，許多學(xué)者將統(tǒng)計(jì)學(xué)中的主成分分析、聚類分析、判別分析等應(yīng)用于水產(chǎn)動物雌雄個(gè)體形態(tài)差異的比較，如岳亮等［14］依據(jù)所建立的判別方程對72尾紅鰭東方鲀（Takifugurubripes）的雌雄判別準(zhǔn)確率為81.9%；諶微等［29］對554尾大黃魚（Larimichthyscrocea）進(jìn)行了主成分分析及判別分析等，其結(jié)果顯示，雌魚個(gè)體間變異較雄魚更大，其中體厚指標(biāo)差異最顯著；周惠強(qiáng)等［30］對248尾大刺鰍（Mastacembelusarmatus）進(jìn)行差異顯著性分析、主成分分析、R-聚類分析和判別分析后得出，大刺鰍雌性個(gè)體相較于雄性個(gè)體頭部和軀干部較長，眼距較寬，體高較高，其判別方程準(zhǔn)確率為69.2%，研究結(jié)果為魚類性別鑒定提供了借鑒。

本研究通過296尾暗紋東方鲀的11項(xiàng)計(jì)量性狀和11項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化性狀，采用主成分分析、逐步判別分析和t檢驗(yàn)的方法，最終篩選出眼徑、肥滿度、頭長／體長、尾柄高／體長、體寬／體長5個(gè)相關(guān)變量，并建立了暗紋東方鲀雌、雄判別模型。本研究發(fā)現(xiàn)，2～3月齡的暗紋東方鲀雌雄個(gè)體差異主要集中在尾部特征和長寬比例上，雄性個(gè)體較雌性個(gè)體尾柄在比例上相對較窄，體型相對窄長。與同為東方鲀屬的紅鰭東方鲀相比，岳亮等［14］的研究表明，紅鰭東方鲀雄性特征為體形較寬、體周長較長，形成此差異的原因可能是兩者選取的養(yǎng)殖群體年齡不同。性腺的發(fā)育程度能夠影響鲀類的腹圍和體寬。岳亮等［14］選取2～3年齡的紅鰭東方鲀，其雄性個(gè)體性成熟較早，雌性個(gè)體未性成熟，因此造成雄性特征為體形較寬、體周長較長，與華元渝等［31］的研究結(jié)果契合。而本研究選取2～3月齡的暗紋東方鲀幼魚，其雌雄個(gè)體生長速度區(qū)分不明顯，性腺發(fā)育不成熟，體型差異受性腺影響較小，2～3月齡雄魚反而體型相對較窄，與岳亮等［14］的研究結(jié)果相反。因?yàn)槟壳安o對暗紋東方鲀幼魚的生長特征研究，根據(jù)本研究結(jié)果推測，雄魚偏窄的尾柄和體型可能使其更加靈活，擴(kuò)大其生存優(yōu)勢。運(yùn)用逐步判別分析所建立的雌雄判別方程，其對暗紋東方鲀雌雄個(gè)體綜合判別的正確率為81.1%，表明依據(jù)所選出的5個(gè)外形特征可以用于判別其性別，值得注意的是本方法仍具有一定局限性，所構(gòu)建的方程對群體要求較高，由于不同群體生活環(huán)境等的差異，即使年齡相同也可能存在較大差異，因此在應(yīng)用此法時(shí)最好根據(jù)所養(yǎng)殖的群體重新構(gòu)建判別方程，以免造成較大誤差，在岳亮等［14］、吳波等［21］的研究中也表明了這一點(diǎn)。本研究從形態(tài)學(xué)方面，利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法對暗紋東方鲀雌雄進(jìn)行鑒定，耗時(shí)短、操作簡單、基本無需成本，在實(shí)際生產(chǎn)中降低了對技術(shù)人員的依賴性，是一種簡便可行的暗紋東方鲀性別鑒定方法，也為其他魚類性別鑒定提供了借鑒。