徐菁，劉曉燕,2*，郭銀萍，穆興燕

(1.貴陽學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，貴陽 550005；2.貴州省果品加工技術(shù)研究中心，貴陽 550005)

小黃姜(GlobbaracemosaSmith)，姜科姜屬植物，其切面純黃色，味辛辣濃，肉細嫩，味香，纖維較細[1]，具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖和心血管保護活性[2]，是一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物。生姜中含有的有效成分很多，結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，目前已鑒定出來的成分已經(jīng)達到100多種，主要可以分為揮發(fā)油、姜酚和二苯基三大類[3]。姜的辛辣味道歸因于姜酚(GNS)的存在，GNS是一組揮發(fā)性酚類化合物，對人體健康和營養(yǎng)有重要貢獻[4-5]，具有多種生物活性，從抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎、抗過敏到各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性[6]。

姜酚的提取主要采用傳統(tǒng)的費時費力的方法，如超臨界CO2萃取法、微波提取法、溶劑提取法等，提取過程中會產(chǎn)生大量的污染物，有機溶劑浪費。鑒于此，尋找更高效、更節(jié)能的提取方法迫在眉睫，生物酶解提取法是一種較新的方法，生物酶解提取法是指在傳統(tǒng)提取方法的基礎(chǔ)上，采用酶類酶解細胞壁及間質(zhì)中的纖維素等物質(zhì)[7]，其中纖維素酶能高效地對植物細胞壁組分進行酶解，促進細胞壁內(nèi)有效成分的釋放[8]。超聲波提取法主要利用超聲波的空化、機械和熱效應(yīng)加速有效成分的溶出[9-10]，二者相輔相成的促進作用顯著提高了提取效率，鑒于此，本課題采用纖維素酶與超聲結(jié)合法提取小黃姜中的姜酚，采用正交試驗優(yōu)化小黃姜姜酚的提取條件，并進行抗氧化活性研究，姜酚是生姜中的主要活性成分，所以本文旨在為姜酚有效成分的提取提供新途徑，為姜酚深加工技術(shù)的發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

小黃姜：購自貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣黔棠姜生物科技有限公司。經(jīng)清洗、切片、液氮速凍，小型粉碎機粉碎，裝盤，放入真空冷凍干燥機中凍干，凍干條件0.1 kPa，凍干時間18 h，凍干粉取出后用自封袋裝好放置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

纖維素酶(綠色木霉，50 U/mg，Lot：H31A11S122948)：上海源葉生物科技有限公司；香蘭素(香草醛，分析純AR)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸-水、檸檬酸鈉：大自然生物集團有限公司；乙醇(100%，分析純AR)：天津康耐珂德科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 主要儀器

CS-2001-02粉碎機 永康市天棋盛世工貿(mào)有限公司；BILKON-FD5BD真空冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；FAB1243分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；TDZ5-WS高速離心機 湖南平凡科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小黃姜中姜酚的提取工藝

小黃姜→清洗→液氮速凍→粉碎→冷凍干燥→纖維素酶處理→超聲處理→離心→測定。

1.2.2 香草醛標準溶液的配制

精確稱取香草醛標準品0.5 g，移入100 mL容量瓶中用無水乙醇定容、搖勻，再精確吸取5 mL，移入100 mL容量瓶中用無水乙醇定容，得0.25 mg/mL香草醛標準溶液，備用。

1.2.3 測定條件的選擇

姜酚目前沒有固定標品，因香草醛與姜酚的母核結(jié)構(gòu)相似，故本文選用香草醛作為對照標準[11]。以無水乙醇作為空白對照，將香草醛的無水乙醇溶液及姜酚的無水乙醇提取液進行紫外波長掃描，掃描波長范圍在200～400 nm，紫外吸收曲線見圖1。由紫外吸收曲線可知，香草醛和小黃姜的乙醇粗提液都在280 nm處有顯著的吸收波長。

圖1 無水乙醇姜酚粗提液(a)和無水乙醇香草醛溶液(b)Fig.1 The anhydrous ethanol gingerol crude extract (a) and anhydrous ethanol vanillin solution (b)

1.2.4 香草醛標準曲線制備

參考劉軍偉等[12]的方法，稍作調(diào)整。配制質(zhì)量濃度為250 μg/mL的香草醛標準溶液，準確吸取香草醛標準溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中[13]，用無水乙醇定容到刻度線，渦旋混合均勻?？瞻讓φ諡橐掖?100%)，檢測波長為280 nm，測定其吸光度值。

由圖2可知，y軸表示測定的吸光度值A(chǔ)，x軸表示濃度(μg/mL)，標準曲線的回歸方程為y=0.0624x-0.1266，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，線性關(guān)系良好。

圖2 香草醛標準曲線Fig.2 The standard curve of vanillin

1.2.5 姜酚的提取

精確稱取小黃姜冷凍干燥粉1 g，按照料液比1∶20(g/mL)加入20 mL pH 5的緩沖溶液，添加0.04 g纖維素酶，在水浴鍋溫度50 ℃下酶解1 h后，96 ℃滅酶3.5 min。加入20 mL無水乙醇，在200 W超聲功率下超聲30 min，在轉(zhuǎn)速2500 r/min下離心10 min后取上清液1 mL定容至10 mL，在280 nm處測其吸光度值。根據(jù)標準曲線，計算相應(yīng)的含量：

姜酚=(2.001V0V1C)/(V2W×106)×100%。

式中：2.001為香草醛換算成姜酚的系數(shù)；V0為樣品提取液總體積(mL)；V1為測定樣液總體積(mL)；C為香草醛濃度(μg/mL，回歸方程中求出)；V2為測定的樣品溶液體積(mL)；W為稱取的樣品量(g)。

1.2.6 單因素試驗設(shè)計

1.2.6.1 料液比的選擇

在固定條件：超聲功率、時間、溫度分別為250 W、30 min、50 ℃，酶添加量0.03 g、pH 5、酶解溫度50 ℃、酶解時間60 min下，考察其料液比為1∶0、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL )時對姜酚提取率的影響。

1.2.6.2 酶添加量的選擇

在固定條件：超聲功率、時間、溫度分別為250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶解溫度50 ℃、酶解時間60 min下，考察酶添加量分別為0.01，0.03，0.05，0.07，0.09 g時對姜酚提取率的影響。

1.2.6.3 酶解溫度的選擇

在固定條件：超聲功率、時間、溫度分別為250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.05 g、酶解時間60 min下，以30，40，50，60，70 ℃作為酶解溫度考察指標，探究不同酶解溫度對姜酚提取率的影響。

1.2.6.4 酶解時間的選擇

在固定條件：超聲功率、時間、溫度分別為250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.05 g，酶解溫度50 ℃下，以20，40，60，80，100 min作為酶解時間考察指標，探究不同酶解時間對姜酚提取率的影響。

1.2.6.5 pH的選擇

在固定條件：超聲功率、時間、溫度分別為250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、酶添加量0.05 g、酶解溫度50 ℃、酶解時間40 min，以3，4，5，6，7作為pH考察指標，探究不同pH對姜酚提取率的影響。

1.2.6.6 超聲時間

在固定條件：超聲功率、溫度分別為250 W、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.03 g、酶解溫度50 ℃、酶解時間40 min，以10，20，30，40，50 min作為超聲時間考察指標，探究不同超聲時間對姜酚提取率的影響。

1.2.6.7 超聲溫度

在固定條件：超聲功率、時間分別為250 W、30 min，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.05 g、酶解溫度50 ℃、酶解時間40 min，以20，30，40，50，60 ℃作為超聲溫度考察指標，探究不同超聲溫度對姜酚提取率的影響。

1.2.7 P-B試驗設(shè)計

P-B簡稱爬坡試驗，是從多個單因素中篩選出對試驗影響最大的單因素的方法[14]。主要是對單因素中每個因子取(+1)和(-1)兩水平進行分析，通過比較各個因子(+1)和(-1)的差異與整體的差異來確定因子的顯著性。通過 P-B試驗對7個單因素的篩選，能夠減少在后面的優(yōu)化試驗中由于因素太多或部分因子不顯著而耽誤試驗進度和影響試驗結(jié)果[15]。

本試驗采用N=12的試驗設(shè)計，對影響小黃姜姜酚提取率的7個因素料液比(A)、酶添加量(B)、酶解溫度(C)、酶解時間(D)、pH(E)、超聲時間(F)、超聲溫度(G)進行篩選。每個因素取高(+1) 、低(-1)兩個水平，以提取率作為響應(yīng)值(Y)，其取值見表1。

表1 P-B試驗設(shè)計因素水平取值Table 1 The factors and levels of P-B test design

1.2.8 正交試驗設(shè)計

在單因素和P-B試驗的基礎(chǔ)上，對影響小黃姜姜酚提取率的4個顯著影響因素: pH(E)、料液比(A)、酶解溫度(C)和超聲溫度(G)，設(shè)計L9(34)正交試驗，以此確定最佳提取條件。正交試驗因素與水平表見表2。

表2 正交試驗因素與水平Table 2 The factors and levels of orthogonal test

1.2.9 姜酚粗提物抗氧化活性研究

1.2.9.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考巫永華等[16]的方法，稍作改動，用乙醇(100%)配制DPPH乙醇溶液1 mmol/L，用乙醇(100%)分別配制姜酚粗提液(0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL)。分別取2.0 mL姜酚粗提液、DPPH自由基溶液(1.2 mmol/L)渦旋35 s，混合均勻，暗處放置 30 min，以乙醇(100%)作參照，測定吸光值 A；2.0 mL 粗提液、95%乙醇混合后測定的吸光值為A0；2.0 mL乙醇(100%)+2 mL DPPH溶液混合后測定的吸光值為A1。以上吸光度均在517 nm處測定，以同濃度的Vc作陰性對照，清除率計算公式為：

清除率=[1-(A-A0)/A1]×100%。

1.2.9.2 ABTS 自由基清除能力的測定

參照艾薇等[17]的方法,稍作改動，取ABTS 自由基溶液(6.6 mmol/L)和K2S2O8溶液(3.2 mmol/L)等體積混勻，避光放置17～22 h，將ABTS 自由基溶液用乙醇(100%)進行稀釋，直至吸光度為0.70±0.02。取 0.2 mL樣品液+3.8 mL ABTS自由基溶液，在波長為734 nm下測定吸光值A(chǔ)，同時將0.2 mL乙醇(100%)+3.8 mL ABTS溶液混合后測定其吸光值 A1，以及樣品溶液+乙醇(100%)混合后的吸光值A(chǔ)0，以同濃度的Vc作陰性對照，清除率計算公式為：

清除率=[1-(A-A0)/A1]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

由圖3中(1)可知，在料液比1∶10～1∶50 (g/mL)范圍內(nèi)，當溶劑在10～20 mL時提取率隨著料液比的升高而升高，當溶劑在20～30 mL時提取率下降幅度較大，之后隨著溶劑的增加提取率逐漸降低，這是由于溶劑占比增加導(dǎo)致酶的濃度降低，從而降低了酶與底物的接觸概率；同時也會導(dǎo)致其他雜質(zhì)的溶出[18]，從而降低了小黃姜姜酚提取率，因此料液比選擇1∶20(g/mL)最適宜。

圖3 單因素對小黃姜姜酚提取率的影響Fig.3 The single factor on the extraction rate of gingerol from Globba racemosa Smith

由圖3中(2)可知，在酶添加量0.01～0.09 g范圍內(nèi)，酶添加量在0.01～0.05 g時提取率隨著添加量的增加而升高，0.05 g時達到最大提取率，之后提取率逐漸下降，再增加酶添加量對提取率影響不大。這是因為隨著酶添加量的增加，反應(yīng)逐漸趨于完全，當達到最大添加量時，沒有足夠底物與之接觸，導(dǎo)致酶的作用受到抑制[19]，因此酶的添加量定為0.05 g最恰當。

由圖3中(3)可知，在酶解溫度30～70 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的上升，姜酚提取率也逐漸升高，溫度升高到50 ℃時姜酚提取率達到最大值，隨后姜酚提取率大幅度下降，再提高酶解溫度對提取率影響不大，這是由于酶作用有其最適溫度，超過最適溫度后，隨著溫度的升高，酶活性會降低[20]，因此酶解溫度定為50 ℃最恰當。

由圖3中(4)可知，在酶解時間20～100 min范圍內(nèi)，20～40 min姜酚提取率大幅度上升，40 min以后提取率逐漸下降，這是因為隨著時間的增加，溶出雜質(zhì)逐漸增多，導(dǎo)致提取率下降，因此酶解時間定為40 min最合適。

由圖3中(5)可知，當pH達到5時提取率達到最大值，之后再增加pH對提取率的影響不大，酶在最適pH范圍內(nèi)酶活力比較大，能最大程度發(fā)揮其作用，超過此范圍酶會失活，因此pH 5時最恰當。

由圖3中(6)可知，當超聲時間達到30 min時提取率達到最大值[21]，之后隨著超聲時間的增加，對提取率的影響不大，超聲具有較強的機械效應(yīng)，短時間內(nèi)有利于姜酚的溶出，長時間的作用會破壞姜酚而使姜酚有損失，因此超聲時間為30 min時最恰當。

由圖3中(7)可知，隨著超聲溫度的增大，提取率逐漸升高，溫度升高到40 ℃時提取率達到最大值，隨后隨著溫度的增大，提取率大幅度下降。姜酚由于含量較少，穩(wěn)定性較差，容易受到高溫影響而導(dǎo)致含量減少，因此超聲溫度為40 ℃時最恰當。

2.2 P-B試驗

P-B試驗設(shè)計結(jié)果見表 3，通過對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見表4。

表3 P-B試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 P-B test design and corresponding results

續(xù) 表

表4 P-B試驗設(shè)計回歸分析結(jié)果Table 4 Regression analysis results of P-B test design

由表4可知各因素是否有統(tǒng)計意義，T檢驗顯示：因素G回歸系數(shù)不為0的假設(shè)成立，T=3.21，P=0.033<0.05，有統(tǒng)計意義。同理因素A，C，E有統(tǒng)計意義，可以認為pH(E)、料液比(A)、酶解溫度(C)和超聲溫度(G)這4個因素對試驗結(jié)果具有顯著影響，由圖4可知，標準化效應(yīng)的Pareto圖從上到下順序?qū)?yīng)A～G 7個因素對試驗結(jié)果Y的重要程度，標準化效應(yīng)超過豎線(>2.78)對應(yīng)的因素是顯著影響因素。

圖4 標準化效應(yīng)的Pareto圖Fig.4 The Pareto diagram of standardized effect

2.3 正交試驗結(jié)果

依據(jù)單因素的試驗結(jié)果，以小黃姜姜酚提取率為評價指標，采用L9(34)正交設(shè)計，選擇A，C，E，G 4個因素，確定最佳提取條件的正交試驗結(jié)果與分析(見表5)，方差分析結(jié)果見表6。

表5 提取條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 5 The results of analysis of orthogonal test for optimization of extraction conditions

表6 正交試驗結(jié)果方差分析Table 6 The variance analysis of orthogonal test results

由表5可知，由極差R的大小可知，影響提取率最大的因素是A(料液比)，其次是C(酶解溫度)，再次是E(pH)，最小的是G(超聲溫度)，其影響提取率由大到小排序為A>C>E>G。提取小黃姜姜酚最優(yōu)的條件為A1C2E3G3，即按照料液比1∶10(g/mL)，pH 6，酶解溫度50 ℃，超聲溫度50 ℃。在此最佳提取條件下，小黃姜姜酚提取率為1.917%。

2.4 姜酚抗氧化活性研究

2.4.1 姜酚對DPPH的清除能力

由圖5可知，對照組VC和姜酚均對DPPH自由基表現(xiàn)出了清除能力。姜酚對DPPH的清除率隨著濃度的增加而升高，當濃度超過0.08 mg/mL 時，清除率的上升趨勢有所減緩。VC在試驗濃度范圍內(nèi)，清除率均在90%以上[22]，總體來說，超聲波-纖維素酶法輔助乙醇提取的小黃姜姜酚粗提物具有良好的清除活性。

圖5 姜酚粗提物及Vc對DPPH自由基清除率的影響Fig.5 The effect of gingerol crude extract and Vc on scavenging rate of DPPH free radical

2.4.2 姜酚對ABTS的清除能力

由圖6可知，對照組Vc和姜酚粗提物對ABTS自由基均具有清除能力。姜酚粗提物對ABTS自由基的清除率隨著濃度的升高而變大，且各個濃度間的差異都表現(xiàn)出顯著性[23]，最大濃度的清除率達到67.44%。總體來說，超聲波-纖維素酶法輔助乙醇提取的小黃姜姜酚粗提物具有良好的清除活性。

圖6 姜酚粗提物及Vc對ABTS自由基清除率的影響Fig.6 The effect of gingerol crude extract and Vc on scavenging rate of ABTS free radical

3 結(jié)論

對小黃姜進行了纖維素酶-超聲波輔助法提取的研究，在單因素試驗和Plackett-Burman 試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計正交試驗對提取條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的提取條件為：料液比1∶10(g/mL)，pH 6，酶添加量0.05 g，酶解時間40 min，酶解溫度50 ℃，超聲時間30 min，超聲溫度50 ℃，測得小黃姜姜酚的提取率為1.917%，超聲波輔助結(jié)合纖維素酶解提取法結(jié)合了兩種提取方法的優(yōu)點，利用二者相輔相成的促進作用顯著提高了小黃姜姜酚提取率，具有提取時間短、條件溫和、提取率高等優(yōu)點，為小黃姜中有效成分的提取提供了新途徑，在抗氧化試驗中，隨著姜酚粗提液濃度的增加，姜酚粗提物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率始終略低于Vc，這表明姜酚粗提物對ABTS自由基具有較好的清除能力。