紀(jì)鳳娣，魏巍，陶匯源，李東，夏蓉，魯緋*

(1.北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069；2.鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

多酚類化合物是植物次生代謝自然合成的化合物，可以在一些天然食物中找到，由于具有潛在的保健治療作用，這類化合物引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注[1]。適當(dāng)攝入具有生物活性的多酚類化合物，在預(yù)防糖尿病[2]、肥胖癥[3]、帕金森病[4]、阿爾茨海默病[5]等疾病方面具有良好的效果。目前，多酚在與食品、制藥和材料等有關(guān)的應(yīng)用方面有很大的潛力，也是這些領(lǐng)域的創(chuàng)新熱點(diǎn)。

食醋是我國最受歡迎的調(diào)味品之一，有著悠久的生產(chǎn)歷史[6]。隨著食醋對(duì)人體健康的潛在影響，其在世界范圍內(nèi)引起越來越多的關(guān)注，已有許多報(bào)道證實(shí)各種醋具有抗氧化、抗菌、促進(jìn)疲勞恢復(fù)、調(diào)節(jié)血壓和調(diào)節(jié)血糖等功能性治療特性[7]。多酚類化合物是食醋的重要特征成分，具有抗氧化活性，對(duì)食醋的營養(yǎng)價(jià)值和產(chǎn)品品質(zhì)等指標(biāo)起著重要作用[8-9]。因此，食醋中總多酚的準(zhǔn)確定量，對(duì)控制食醋的品質(zhì)具有十分重要的意義。

多酚類化合物是分子中具有多羥基化合物的總稱，包括黃酮類化合物和酚酸類化合物等[10]。目前，多酚化合物的分析方法主要有高效液相色譜-紫外可見或二極管陣列檢測(cè)法[11-12]、毛細(xì)管電泳檢測(cè)法[13-14]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]等。與其他方法相比，這些儀器分析方法具有更高的準(zhǔn)確性和更低的檢測(cè)限，但是，這些基于色譜和質(zhì)譜的分析方法在應(yīng)用上也有很大的局限性，包括需要繁瑣的樣品預(yù)處理過程和復(fù)雜的儀器，造成每個(gè)樣品的測(cè)試成本偏高。目前，紫外可見分光光度法已廣泛應(yīng)用于多種分析物的定量分析，但由于光譜重疊性強(qiáng)、選擇性低，在多組分溶液分析中仍面臨挑戰(zhàn)。經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)室總酚含量測(cè)定方法是基于光譜檢測(cè)的Folin-Ciocalteu法[17-18]，這是一種方便和簡單的分析總酚含量的技術(shù)，在葡萄酒等多種食品中總酚含量的測(cè)定中有廣泛應(yīng)用[19-21]。但是，這些方法在樣品處理、試劑用量、顯色反應(yīng)條件和實(shí)際測(cè)量以及對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品等方面各不相同，數(shù)據(jù)可比性差。而且，迄今為止，我國也還沒有應(yīng)用于食醋中總多酚含量測(cè)定的統(tǒng)一方法和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

本試驗(yàn)采用分光光度法測(cè)定食醋中總多酚的含量。Folin-Ciocalteu試劑中的鉬鎢酸鹽氧化多酚化合物中-OH基團(tuán)并顯藍(lán)色，在最大吸收波長760 nm處測(cè)定藍(lán)色金屬絡(luò)合物溶液的吸光度，以沒食子酸作校正標(biāo)準(zhǔn)定量測(cè)定食醋中總多酚含量。通過對(duì)包括樣品處理、顯色劑用量、顯色條件和測(cè)量時(shí)間等影響顯色反應(yīng)的各影響因素進(jìn)行優(yōu)化，確定了食醋中總多酚的定量分析方法。該方法簡便、準(zhǔn)確且檢測(cè)成本低、儀器普及率高、適用性強(qiáng)。此外，也比較了市售的中國四大名醋(包括鎮(zhèn)江香醋、山西老陳醋、福建永春紅曲醋和四川保寧醋)中總多酚的含量。研究結(jié)論為我國食醋中總多酚含量測(cè)定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了理論依據(jù)，為當(dāng)前我國食醋產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品品質(zhì)的快速精準(zhǔn)檢測(cè)提供了有效的技術(shù)手段，有利于現(xiàn)階段食醋產(chǎn)品的質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沒食子酸(98%)：成都埃法生物科技有限公司；Folin-Ciocalteu試劑(相應(yīng)酸濃度為2 mol/L)：美國Sigma-Aldrich公司；碳酸鈉(分析純)：北京化工廠。所有稀釋液均由美國密理博(Millipore)Milli-Q凈水系統(tǒng)生產(chǎn)的去離子水制備。

鎮(zhèn)江香醋、山西老陳醋、福建永春紅曲醋和四川保寧醋：北京超市市售產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550型紫外可見分光光度計(jì) 日本島津制作所；LAB MX-F渦旋混合器 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司；CF16RN多用途冷凍離心機(jī) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取沒食子酸對(duì)照品適量于100 mL棕色容量瓶中，用水溶解后定容至刻度，搖勻，配制成濃度約為100 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 食醋樣品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.5 g(±0.0001 g)食醋樣品于50 mL棕色容量瓶中，加入約40 mL水，于30～35 ℃超聲30 min，在室溫下用水定容至刻度，搖勻備用(也可于8000 r/min離心后取上清液備用)。

1.3.3 檢測(cè)波長的確定

準(zhǔn)確量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、食醋樣品溶液及水各1 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，渦旋混勻，靜置3～5 min后加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，渦旋混勻，在1～8 min內(nèi)各加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，渦旋混勻，再用水定容至刻度，搖勻。避光放置于30 ℃水浴中2 h，于200～800 nm進(jìn)行全波長掃描。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和食醋樣品溶液全波長掃描圖見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和食醋樣品溶液(B)全波長掃描圖Fig.1 The scanning spectra of gallic acid standard solution (A) and vinegar sample solution (B)

由圖1可知，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和食醋樣品溶液在759.1 nm均有一個(gè)最大吸收峰，且空白溶液無干擾，故選擇760 nm作為檢測(cè)波長。

1.3.4 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確量取1.3.1項(xiàng)下沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20，0.40，0.60，0.80，1.0 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，各加入4 mL水，渦旋混勻后按照1.3.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，同時(shí)以水為空白樣品進(jìn)行顯色，于760 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg/mL。

1.3.5 空白溶液的制備

加入5 mL水于10 mL棕色容量瓶中，按照1.3.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，于760 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.6 食醋測(cè)試樣品的制備

準(zhǔn)確量取1.3.2項(xiàng)下食醋樣品溶液1.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，渦旋混勻后按照1.3.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，于760 nm處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品做3份平行，結(jié)果取平均值。

1.3.7 計(jì)算公式

式中：W為食醋中總多酚含量(g/100 g)；c為試驗(yàn)樣品溶液中多酚組分濃度(μg/mL)；m為食醋樣品的稱樣量(g)；結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 食醋樣品溶液制備用溶劑的選擇

準(zhǔn)確稱取0.5 g(±0.0001 g)食醋樣品于50 mL棕色容量瓶中，平行3份，分別加入約40 mL水、25%乙醇和50%乙醇，于30～35 ℃超聲30 min，室溫下分別用水、25%乙醇和50%乙醇定容至刻度，搖勻后于8000 r/min離心后取上清液備用。準(zhǔn)確量取上述食醋樣品溶液1.0 mL，按照1.3.3項(xiàng)下方法顯色后在760 nm處測(cè)定吸光度，綜合分析測(cè)定結(jié)果，確定水作為食醋樣品溶液的制備用溶劑。

2.2 顯色時(shí)間的考察

對(duì)試驗(yàn)樣品的分析中，其他操作不變，加入顯色劑并定容后，在0～180 min內(nèi)每隔20 min在760 nm處測(cè)定吸光度值，結(jié)果表明試驗(yàn)樣品在顯色120 min后，吸光度值趨于穩(wěn)定，故確定顯色反應(yīng)時(shí)間為2 h，并且在隨后的20 min內(nèi)測(cè)定得到的吸光度值非常穩(wěn)定。

2.3 顯色劑用量的考察

對(duì)試驗(yàn)樣品的分析中，其他操作不變，僅改變Folin-Ciocalteu試劑的用量(0.25，0.5，0.75，1.0 mL)，或僅改變20%碳酸鈉溶液的用量(1.0，1.5，2.0，2.5 mL)，同法測(cè)定吸光度。比較所得吸光度值后確定0.5 mL的Folin-Ciocalteu試劑和1.5 mL的碳酸鈉溶液為最佳顯色劑用量。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

根據(jù)1.3.4項(xiàng)下的方法，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到線性回歸方程為Y=0.1148X-0.2087，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。結(jié)果表明沒食子酸在2.0～10.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

取1.3.4項(xiàng)下10.0 μg/mL的測(cè)試用標(biāo)準(zhǔn)溶液，于760 nm處連續(xù)測(cè)定吸光度9次，RSD為0.051%，表明該方法的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確量取1.3.2項(xiàng)下的食醋樣品溶液1.0 mL，按照1.3.3項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)2 h，然后于760 nm處每隔5 min測(cè)定一次吸光度值。結(jié)果顯示：顯色反應(yīng)完成后，測(cè)試樣品在20 min內(nèi)吸光度值的RSD為1.40%，表明樣品吸光度值在20 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性

以Folin-Ciocalteu法測(cè)定總多酚，試驗(yàn)會(huì)受到多種干擾化合物(包括抗壞血酸、糖(果糖和蔗糖)、芳香胺、二氧化硫、有機(jī)酸和Fe(II)等)的干擾，這些干擾物質(zhì)在水溶液中溶解性良好。眾所周知，食醋是以乙酸為主要成分的一種酸味調(diào)味料，在我國傳統(tǒng)的食醋中除乙酸外，還含有多種有機(jī)酸、氨基酸、碳水化合物、酯類、食鹽和多種微量天然生物活性物質(zhì)如四甲基吡嗪、黃酮類化合物和酚酸類化合物。目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19777-2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》規(guī)定，山西老陳醋中的總黃酮含量應(yīng)不低于60 mg/100 g，國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2719-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食醋》規(guī)定總酸(以乙酸計(jì))應(yīng)不低于3.5 g/dL。顯然，高含量的乙酸等有機(jī)酸的存在可能會(huì)干擾總多酚含量的測(cè)定。因此，有必要考察乙酸對(duì)試驗(yàn)的影響。

準(zhǔn)確稱取乙酸含量為4.3%的白醋樣品0.5000 g于50 mL棕色容量瓶中，按照1.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行白醋樣品溶液的制備和顯色反應(yīng)，結(jié)果顯示：白醋測(cè)試樣品的吸光度值與空白樣品的吸光度值一致，這說明白醋樣品確實(shí)不含多酚類化合物，同時(shí)也證明食醋中的乙酸對(duì)Folin-Ciocalteu法測(cè)定總多酚含量的干擾可以忽略。

對(duì)測(cè)定方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了考察。準(zhǔn)確稱定6份0.5000 g的食醋樣品于6個(gè)50 mL棕色容量瓶中，精密加入1.3.1項(xiàng)下的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(沒食子酸的加入量為1081 μg)，按照1.3.2食醋樣品溶液配制方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，再依據(jù)1.3.3項(xiàng)下顯色條件進(jìn)行顯色反應(yīng)并測(cè)定吸光度值。食醋樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)測(cè)得的吸光度值和計(jì)算的回收率見表1。結(jié)果顯示：平均加標(biāo)回收率為97.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.37%，說明該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》的規(guī)定。

表1 食醋樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of spiked recovery test for vinegar samples (n=6)

2.4.5 我國四大名醋樣品中總多酚的含量測(cè)定

我國各類食醋無論從釀造工藝的特色、產(chǎn)品的質(zhì)量還是受消費(fèi)者歡迎的程度，基本上都是從鎮(zhèn)江香醋、山西老陳醋、四川保寧醋和福建永春紅曲醋這4個(gè)類型變化和衍生而來的，因此也稱它們?yōu)橹袊拇竺祝侵袊鴤鹘y(tǒng)釀造食醋的代表。對(duì)市售5年陳釀四大名醋中的總多酚含量進(jìn)行了分析，結(jié)果見表2。

表2 中國四大名醋總多酚含量測(cè)定結(jié)果Table 2 The determination results of total polyphenols＇ content in four Chinese famous vinegar

結(jié)果顯示：四大名醋總多酚含量在0.237～0.604 g/100 g的范圍內(nèi)。其中，四川保寧醋的總多酚含量最高，為0.604 g/100 g，福建永春米醋的總多酚含量最低，為0.237 g/100 g。這證明不同工藝、不同品牌的食醋產(chǎn)品總多酚含量不同，而總多酚含量是評(píng)價(jià)食醋品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)基于Folin-Ciocalteu法測(cè)定食醋中總多酚含量的影響因素進(jìn)行了考察和優(yōu)化。通過對(duì)食醋樣品處理?xiàng)l件、顯色反應(yīng)時(shí)間、顯色劑用量和測(cè)量時(shí)間等因素的考察，確定了食醋中總多酚含量的測(cè)定方法為：準(zhǔn)確稱取0.5 g(±0.0001 g)食醋樣品于50 mL棕色容量瓶中，加入4 mL水，渦旋混勻，靜置3～5 min后加入0.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，渦旋混勻，在1～8 min內(nèi)各加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，渦旋混勻后再用水定容至刻度，搖勻。避光放置于30 ℃水浴中2 h顯色，并在20 min內(nèi)于760 nm處測(cè)定吸光度。該方法溶液體系均一，線性良好，準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性高，精密度和重復(fù)好，儀器普及率高且操作方便、簡單，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可比性強(qiáng)，易于推廣，可以應(yīng)用于食醋產(chǎn)品質(zhì)量控制和品質(zhì)評(píng)價(jià)中總多酚含量的測(cè)定。