劉宇，楊巧，王曉丹，趙春雷，王希，李彥麗，賈海倫，丁廣洲，陳麗

（1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2.黑龍江省甜菜工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150080；3.國家糖料改良中心，哈爾濱 150080；4.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080；5.國家甜菜種質(zhì)中期庫，哈爾濱 150080）

0 引言

世界糖產(chǎn)量每年約1.6億t，其中甜菜糖占20%左右，人均食糖消費(fèi)量約為23 kg，由于中國和印度等人口稠密國家生活水平的提高，每年用糖的需求量在不斷增加。盡管甜菜是耐旱作物，但甜菜的生產(chǎn)區(qū)域正面向鹽堿、干旱、冷涼地區(qū)擴(kuò)展[1]，面臨著嚴(yán)重不利外界條件的影響，各種生物脅迫和非生物脅迫都會(huì)使甜菜減產(chǎn)。所以，挖掘甜菜的抗性基因非常重要，可以為甜菜的抗性育種提供理論依據(jù)。

植物基因組中有許多轉(zhuǎn)錄因子家族，它們一般通過結(jié)合靶基因的啟動(dòng)子激活或抑制其表達(dá)，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。BTB（Broad-complex,tramtrack,and bric-à-brac）家族就是這樣的一類轉(zhuǎn)錄因子，其特征是存在高度保守的BTB結(jié)構(gòu)域，也被稱為POZ（痘病毒鋅指蛋白）結(jié)構(gòu)域[4-5]。BTB蛋白一般由5 個(gè)α-螺旋（A1～A5）和3 個(gè)β-折疊（B1～B3）組成[6]，這有利于BTB 蛋白與其它蛋白進(jìn)行互作，如BTB 蛋白能夠與E3 連接酶CULLIN3 相互作用，形成E3 泛素連接酶復(fù)合物的一部分參與目標(biāo)蛋白的泛素化過程[7]。BTB蛋白家族除了包含BTB蛋白結(jié)構(gòu)域外，還存在其他幾種蛋白結(jié)構(gòu)域，如鋅指蛋白（TAZ）、Kelch、BTB和C端Kelch（BACK）、meprin and TRAFhomology（MATH）以及Ankyrin repeats（ANK），從而使BTB蛋白形成了不同亞家族，并發(fā)揮著不同的作用[4-5]。在這些亞家族中，BT-TAZ（BT）蛋白只存在于植物中，它的N 端是BTB 結(jié)構(gòu)域，中心是TAZ結(jié)構(gòu)域，C端是鈣調(diào)素結(jié)合域（CaMBD）[8-9]。

BTB蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性、蛋白質(zhì)泛素化和降解、細(xì)胞骨架組成、離子通道及細(xì)胞周期調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用[10-11]?，F(xiàn)有的研究表明，含有BTB蛋白的ATETO1、ATEOL1和ATEOL2蛋白可以調(diào)節(jié)乙烯的合成[12]；含有BTB 的BT2 可以介導(dǎo)多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并對(duì)脅迫和激素做出反應(yīng)；含有ANK 和BTB 的ATBOP1蛋白，在植物的形態(tài)建成中起著關(guān)鍵的作用[13]。根據(jù)已有的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥NPR1（非表達(dá)的發(fā)病機(jī)制的相關(guān)基因1）蛋白含有BTB 結(jié)構(gòu)域，是誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性（ISR）和系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。植物中許多BTB蛋白家族成員參與了激素介導(dǎo)的植物相關(guān)信號(hào)的調(diào)控，如水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）[14]。AHT1（ABA-HYPERSENSITIVE BTB/POZ PROTE IN1）是一種含有BTB 的蛋白，對(duì)ABA 介導(dǎo)的抑制擬南芥萌發(fā)具有負(fù)調(diào)控作用[15]。另據(jù)報(bào)道，擬南芥中6 種BTB/POZ-MATH 蛋白（BPMS）參與ABA 反應(yīng)，如調(diào)節(jié)萌發(fā)和氣孔關(guān)閉[16]。ATHB6（Homeobox-leucine zipper 轉(zhuǎn)錄因子）能負(fù)調(diào)控ABA 并參與BPMS 的泛素化和降解[15]。近年來，在許多植物物種中發(fā)現(xiàn)了BTB 家族成員，包括擬南芥[8]、水稻[17]、番茄[5]和蘋果[18-19]，但是關(guān)于甜菜BTB 家族的報(bào)道很少。然而，只有少數(shù)BTB 蛋白在功能上得到了驗(yàn)證。本研究中，針對(duì)甜菜基因組對(duì)甜菜的BTB 家族進(jìn)行挖掘，然后對(duì)甜菜的BTB 蛋白家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)研究其在甜菜的抗逆分子生物學(xué)機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甜菜BTB家族基因的挖掘和蛋白的理化性質(zhì)分析

利用SMART 數(shù)據(jù)庫（http://smart.embl-heidelberg.de/）獲得甜菜中所有包含BTB 結(jié)構(gòu)域的蛋白；并通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Pfam 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.sanger.ac.uk/）加以驗(yàn)證，最終篩選出甜菜的BTB 蛋白家族，并獲得甜菜BTB 蛋白家族的基因序列和蛋白序列。利用擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（TAIR，https://www.arabidopsis.org/），獲得擬南芥BTB 基因序列和蛋白序列[20]。使用在線軟件pI/Mw（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)所獲得的49個(gè)甜菜BTB家族蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2 甜菜BTB家族基因的結(jié)構(gòu)分析

在Ensemblgenomes（http://ensemblgenomes.org/）下載已鑒定的甜菜BTB 家族的DNA 序列和CDS 序列，用GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）制作基因結(jié)構(gòu)圖[21]。

1.3 甜菜BTB蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將獲得的甜菜BTB 蛋白家族的蛋白序列利用SMART、NCBI Conserved Domain search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、Pfam（http://pfam.xfam.org/search）分析，最后利用TBtools預(yù)測(cè)的甜菜BTB蛋白家族的結(jié)構(gòu)域，利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 甜菜BTB家族基因的染色體定位分析

在Ensemblgenomes（http://ensemblgenomes.org/）獲得基因的位置信息，通過MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）獲得甜菜BTB家族基因的染色體定位圖。

1.5 甜菜BTB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Clustal Omega program（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）對(duì)甜菜49 個(gè)BTB蛋白（BVRBs）及擬南芥80 個(gè)BTB蛋白（AtBTBs）進(jìn)行多序列比對(duì)分析后，利用evolview（https://evolgenius.info/evolview-v2/#login）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)次數(shù)為1 000 次[22]，并結(jié)合Evolview 構(gòu)建的甜菜與擬南芥系統(tǒng)發(fā)育樹最終確定蛋白結(jié)構(gòu)域并對(duì)其進(jìn)行分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜BTB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)甜菜49 個(gè)BTB 蛋白（BVRBs）和擬南芥80 個(gè)BTB 蛋白（AtBTBs）的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的擬南芥BTB 蛋白亞家族的分類，甜菜BTB 蛋白被分為9 個(gè)亞家族[19-20]：Ankyrin、Armadillo、MATH、NPH3、BACK、TAZ、TPR、BTB-only、Other，在同一亞家族中，甜菜和擬南芥BTB 蛋白的數(shù)量差異較大。其中NPH3 亞家族的數(shù)量最多，包含16 個(gè)甜菜BTB 家族基因，30 個(gè)擬南芥BTB 家族基因；TPR亞家族的數(shù)量最少，只包含1個(gè)甜菜BTB家族基因，3個(gè)擬南芥BTB家族基因（圖1）。

圖1 甜菜與擬南芥BTB家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of BTB family in Beta vulgaris L.and Arabidopsis thaliana

2.2 甜菜BTB蛋白的理化性質(zhì)分析

由表1可以看出49個(gè)蛋白編碼的氨基酸數(shù)目為139～1 120個(gè)，其中BVRB_007930包含的氨基酸數(shù)目最多，為1 120 個(gè)，BVRB_3g058930 最少，只有139 個(gè)；49 個(gè)蛋白的等電點(diǎn)范圍在4.70～9.51，除了TAZ 亞家族與NPH3 亞家族部分的蛋白，其他家族等電點(diǎn)都分布在4.70～7.89，說明甜菜BTB 家族編碼的氨基酸大多數(shù)都為酸性氨基酸；除BVRB_7g159950、BVRB_05090外，其他蛋白的平均親疏水性都為負(fù)值，說明甜菜BTB蛋白家族大部分屬于親水性蛋白；49個(gè)BTB蛋白的磷酸化位點(diǎn)數(shù)目分布在3～25個(gè)，不同蛋白磷酸化位點(diǎn)數(shù)目差異很大，從3種磷酸化位點(diǎn)的數(shù)目上看，絲氨酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)目最多，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)次之，酪氨酸最少；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，甜菜BTB 家族的大部分蛋白位于細(xì)胞核（36 個(gè)），剩余的蛋白分別位于細(xì)胞膜和葉綠體上；49 個(gè)蛋白的分子量為15 848.66～124 344.33 Da，除少數(shù)蛋白分子量過大或過小，大部分蛋白分子量范圍在50 000～80 000 Da。

表1 甜菜BTB 蛋白家族的理化性質(zhì)分析Table 1 Physical and chemical properties of BTB protein family in sugar beet

續(xù)表1 Continued Table 1

2.3 甜菜BTB家族基因結(jié)構(gòu)分析

甜菜BTB家族不同亞族的基因結(jié)構(gòu)存在較大的差異，比如Other亞家族的基因結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，大部分成員都不含內(nèi)含子；Armadillo 亞家族的內(nèi)含子數(shù)量最多，含有18 個(gè)內(nèi)含子；BACK 亞家族的內(nèi)含子長(zhǎng)度較長(zhǎng)（圖2）。

圖2 甜菜BTB蛋白家族的基因結(jié)構(gòu)Fig.2 The genetic structure of BTB protein family genes in sugar beet

2.4 甜菜BTB蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，甜菜BTB蛋白家族大多數(shù)含有2～3個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖3），不同的結(jié)構(gòu)域可以行使不同的功能，說明甜菜BTB蛋白家族的功能具有多樣性。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，甜菜BTB蛋白家族以α螺旋和β折疊為主（圖4），但不同亞家族的結(jié)構(gòu)域數(shù)量存在著差異，這也是不同亞家族功能差異的原因之一。

圖3 甜菜BTB蛋白家族的結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Domain analysis of BTB protein family in sugar beet

圖4 甜菜BTB亞家族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of tertiary structure of sugar beet BTB subfamily protein

2.5 甜菜BTB家族基因染色體定位分析

由甜菜49個(gè)BTB基因的染色體定位（圖5）可看出，甜菜BTB家族成員呈不均勻分布，其成員主要分布在5、6、7號(hào)染色體上，而1、3、8號(hào)染色體上分布的基因最少，只含有2個(gè)BTB成員。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在5號(hào)和6號(hào)染色體上的BTB家族成員呈區(qū)域性分布，主要集中在染色體上的某段區(qū)域。

圖5 甜菜BTB蛋白家族基因的染色體定位Fig.5 The chromosome location of BTB protein family genes in sugar beet

3 討論與結(jié)論

目前在玉米中鑒定出BTB 家族蛋白70 條[23]，擬南芥中鑒定出80 個(gè)BTB 蛋白，水稻中鑒定出149 個(gè)BTB蛋白[6,17]，說明不同物種間BTB 蛋白數(shù)量存在較大差異。本研究從SMART 數(shù)據(jù)庫中共篩選到49 條完整的甜菜BTB 家族蛋白，并通過相關(guān)生物信息學(xué)工具對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。本研究結(jié)果表明：（1）將甜菜BTB的家族蛋白和擬南芥BTB的家族蛋白通過聚類分析法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，由于BTB家族的保守性，具有相似或者相同功能的基因位于同一組，可以分為Ankyrin、Armadillo、MATH、NPH3、BACK、TAZ、TPR、BTBonly、Other亞家族，同時(shí)也說明BTB 家族在進(jìn)化上一直趨于保守，我們可以利用BTB家族的保守性來推測(cè)甜菜BTB 家族的功能。（2）不同亞族蛋白的染色體結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域都存在著差異，染色體結(jié)構(gòu)與基因的表達(dá)有關(guān)，結(jié)構(gòu)域與蛋白的功能行使有關(guān)，推測(cè)各個(gè)亞族的功能有所不同。對(duì)49 個(gè)蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，不同組別蛋白在編碼氨基酸數(shù)目、平均等電點(diǎn)等方面存在差異，這也可能決定了不同組別蛋白執(zhí)行不同生物學(xué)功能。（3）蛋白的磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的重要機(jī)制，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要作用，有相關(guān)報(bào)道表明一些蛋白及其它轉(zhuǎn)錄因子蛋白可以通過磷酸化提高植物的抗逆能力[24]。本研究中49 個(gè)蛋白含有3～25 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，說明每個(gè)BTB 蛋白的部分或全部磷酸化位點(diǎn)都有可能被特定的蛋白激酶磷酸化，從而響應(yīng)外界的各種生物和非生物脅迫。（4）對(duì)49個(gè)甜菜BTB 蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，其中的36 個(gè)定位于細(xì)胞核上，其余的分別定位于葉綠體、細(xì)胞膜中，說明大多數(shù)蛋白都是在細(xì)胞核中對(duì)下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以適應(yīng)外界的環(huán)境變化，而定位在其它部位的蛋白則需通過進(jìn)一步試驗(yàn)來確定其功能。（5）染色體定位結(jié)果表明，甜菜BTB家族在甜菜的所有染色體上都存在，主要集中在5～7號(hào)染色體上，說明BTB家族廣泛參與甜菜的生理活動(dòng)，是維持甜菜正常生命活動(dòng)必不可少的蛋白家族。

近年來，有越來越多關(guān)于BTB蛋白參與植物應(yīng)激反應(yīng)的報(bào)道[2,25]，但甜菜BTB家族的報(bào)道很少，所以對(duì)甜菜BTB家族的研究還有很大的前景。BTB蛋白對(duì)植物的發(fā)育和抗逆性起著重要的作用，比如，BTB成員在配子體的發(fā)育[9]、激素和糖信號(hào)傳導(dǎo)[26]、葉衰老[27]、防御反應(yīng)[28-29]和非生物應(yīng)激反應(yīng)[2]，包括鐵穩(wěn)態(tài)在內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)[16]和硝酸鹽吸收中[25,30]都起著至關(guān)重要的作用。而且越高等的植物所含的BTB 蛋白越多，比如BTB 蛋白廣泛存在于高等開花植物和低等單細(xì)胞植物中，相反，單細(xì)胞藻類，特別是細(xì)小微胞藻（Micromonas pusilla）和綠色鞭毛藻（Ostreococcus lucimarinus），只能編碼較少的BTB 蛋白[31]。本文通過對(duì)甜菜BTB 家族的生物信息學(xué)分析，可為甜菜BTB 家族在冷、鹽、干旱脅迫與生長(zhǎng)發(fā)育，以及生物脅迫反應(yīng)中的功能及表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)，下一步可先觀察BTB家族與甜菜的哪些抗性生理有關(guān)，然后對(duì)甜菜BTB家族進(jìn)行克隆及功能驗(yàn)證。