魏 宇 魯康樂 王 玲 宋 凱 張春曉

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門市飼料檢測(cè)與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門 361061)

高脂飼料是一種脂肪含量相對(duì)較高的高能飼料，可發(fā)揮“節(jié)約蛋白質(zhì)”效應(yīng)[1]，以緩解魚粉等蛋白質(zhì)源的短缺，還可以減少養(yǎng)殖魚類的氨氮排放，起到降低飼料成本和維持養(yǎng)殖環(huán)境的重要作用。特別是隨著高密度集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，高脂飼料被廣泛使用。然而高脂飼料的長(zhǎng)期使用會(huì)加劇肝臟等部位的脂肪沉積，是誘發(fā)養(yǎng)殖魚類脂肪肝的首要因素[2]。魚類脂肪肝早期癥狀隱匿，隨之發(fā)展會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)與飼料利用率下降，一旦遭受病原感染和環(huán)境應(yīng)激極易發(fā)生群體死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，篩選適當(dāng)?shù)娘暳咸砑觿?duì)高脂飼料導(dǎo)致魚類脂肪沉積進(jìn)行調(diào)控非常有必要。

黃連素又稱鹽酸小檗堿，是從黃連、黃柏等植物中提取出來(lái)的生物堿，具有多種重要的生理功能，可有效調(diào)節(jié)脂肪代謝、改善脂肪肝癥狀和氧化應(yīng)激等[3]。陳青青[4]研究發(fā)現(xiàn)，團(tuán)頭魴高脂飼料中添加黃連素可以改善其免疫功能和抑制肝細(xì)胞凋亡，從而緩解高脂飼料導(dǎo)致的脂肪肝發(fā)生。黃連素來(lái)源廣、成本低、副作用小、使用安全、易被吸收，是一種非常有潛力的用于調(diào)控脂肪沉積的物質(zhì)，但其在海水魚上的作用卻未見報(bào)道。

花鱸又稱海鱸、七星鱸，其肉質(zhì)鮮美，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種養(yǎng)殖量較高的海水魚類，根據(jù)《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2019年我國(guó)花鱸養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)18.02萬(wàn)t[5]。然而，花鱸的腹腔體積較大，使用配合飼料養(yǎng)殖的花鱸常導(dǎo)致脂肪在肝臟與腹腔大量沉積，易誘發(fā)脂肪肝，嚴(yán)重危害花鱸養(yǎng)殖的健康發(fā)展。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，花鱸對(duì)飼料脂肪的需求量為8%～10%[6]；然而，實(shí)際生產(chǎn)中為了追求高產(chǎn)量與快速生長(zhǎng)，花鱸飼料的脂肪含量普遍高達(dá)12%～14%。因此，本試驗(yàn)以花鱸為研究對(duì)象，研究了在高脂飼料下添加黃連素對(duì)花鱸生長(zhǎng)、脂肪沉積與脂肪代謝的影響，旨在探討黃連素調(diào)控脂肪沉積的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

本試驗(yàn)選用魚粉、豆粕、谷朊粉為主要蛋白質(zhì)源，魚油、豆油、卵磷脂為脂肪源，配制4種飼料，分別為低脂飼料(LFD組)、低脂飼料+100 mg/kg黃連素(LFD+BBR組)、高脂飼料(HFD組)和高脂飼料+100 mg/kg黃連素(HFD+BBR組)，試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

3)營(yíng)養(yǎng)水平均為實(shí)測(cè)值。Nutrient levels were measured values.

將各種原料粉粹后，按照表1稱取各原料后，逐級(jí)、充分混勻，加適量的水進(jìn)行制粒，制作了粒徑分別為1.5和2.5 mm的2種顆粒飼料，將制粒后的飼料用烘箱烘干后，用自封袋保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2 試驗(yàn)魚與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)所用花鱸魚苗購(gòu)于漳州詔安一家花鱸育苗場(chǎng)，養(yǎng)殖試驗(yàn)在集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院龍舟池養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)場(chǎng)的室內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中進(jìn)行。將花鱸魚苗運(yùn)至實(shí)驗(yàn)場(chǎng)后，先暫養(yǎng)于養(yǎng)殖池中1個(gè)月，在此期間投喂商品飼料。待魚苗適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境后，開始分組進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)。

挑選360尾體質(zhì)健壯、規(guī)格均一的花鱸[初始體重為(2.18±0.01) g]，隨機(jī)分到12個(gè)循環(huán)水養(yǎng)殖缸中，每缸30尾，用4種飼料投喂花鱸，每種飼料投喂3缸。養(yǎng)殖試驗(yàn)周期為8周，養(yǎng)殖試驗(yàn)前2周投喂1.5 mm粒徑的飼料，養(yǎng)殖試驗(yàn)后6周投喂2.5 mm粒徑的飼料。每天飽食投喂2次(08:30和17:30)。記錄每缸魚的攝食量，養(yǎng)殖試驗(yàn)期間保持以下條件：水溫27～32 ℃，溶氧含量≥5 mg/L，鹽度25.0～28.0 g/L，氨氮含量<0.1 mg/L，pH為7.5～8.5。

1.3 樣品采集與分析

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，將魚饑餓24 h后用丁香酚麻醉將魚麻醉(1∶10 000)，撈出稱量并計(jì)數(shù)。每缸隨機(jī)取6尾對(duì)其進(jìn)行尾靜脈采血，離心分離血清后-80 ℃保存，用于檢測(cè)血清生化指標(biāo)；將魚體置于冰上，用剪刀剪開魚體腹部，隨即取出內(nèi)臟團(tuán)，用鑷子將肝臟和腹脂剝離，分別獲得整個(gè)肝臟組織和腹腔脂肪組織(腹脂)，并稱量腹脂的重量以計(jì)算腹脂率，隨后將肝臟和腹脂液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。將每缸剩余的魚體稱重后保存在-20 ℃冰箱中，用作分析魚體全體組成。

血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書的操作步驟進(jìn)行測(cè)定。

肝臟和腹脂的基因表達(dá)按照以下步驟進(jìn)行：

1)總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄。使用TRIzol試劑(TaKaRa)提取-80 ℃凍存的肝臟和腹脂組織總RNA，用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA濃度，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)RNA的完整性。然后使用Prime ScriptRT試劑盒(TaKaRa)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃冰箱保存待用。

2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR。用Premier 5.0軟件進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)，引物合成工作由金唯智生物科技有限公司完成，引物序列如表2所示。加樣上機(jī)，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊)和QuantStudioTM6 Flex熒光定量PCR儀(ABI)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，熒光定量PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包括10 μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(2×)、0.4 μL PCR Forward Primer (10 μmol/L)、0.4 μL PCR Reverse Primer(10 μmol/L)、2.0 μL cDNA 模板、7.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 62 s，95 ℃ 15 s。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for RT-qPCR

續(xù)表2基因名稱Gene names引物序列Primer sequence(5'—3')退火溫度Tm/℃乙酰輔酶A氧化酶AOXF:ATACGTGGTCTGGGAGCCTAR:AGCTGGCTTGGCCTACATTC60脂肪甘油三酯脂肪酶ATGLF:CTTCCTCTCCGCAACAAGTCR:TGGTGCTGTCTGGAGTGTTC60線粒體E3泛素連接酶1Mul1F:GCTGCCGTGATACGAGTCATR:ACGTTGGACAAGGACTGGAC60自噬相關(guān)基因5Atg5F:TCAGTCGCTGCCATTAGAGCR:TCTCGTCACCTGCGAAAACT60PTEN誘導(dǎo)激酶1PINK1F:CTGTGAAAGCCCGGTACACTR:TGATGTGGAACTTTGGGGCA60β-肌動(dòng)蛋白β-actinF:CGCCGCACTGGTTGTTR:TTTGGGGTTCAGGGGG60

1.4 指標(biāo)計(jì)算

增重率(WGR,%)=100×(Wt-W0)/W0；
特定生長(zhǎng)率(SGR, %/d)=100×(lnWt-lnW0)/t;
飼料系數(shù)(FCR)=Wf/(Wt-W0)；
蛋白質(zhì)效率(PER)=(Wt-W0)/Wp；
腹脂率(%)=100×Wa/W。

式中：W0為初始魚總重量(g)；Wt為終末魚總重量(g)；W為單尾魚重量(g)；Wf為攝入的飼料總量(干物質(zhì)基礎(chǔ)，g)；Wp為攝入飼料蛋白質(zhì)總量(g)；Wa為腹脂重(g)；t為飼喂天數(shù)(d)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0分析軟件進(jìn)行雙因素方差分析(two-way ANOVA)，采用Tukey檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，差異水平定為P<0.05。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃連素對(duì)花鱸生長(zhǎng)及飼料利用的影響

黃連素對(duì)花鱸生長(zhǎng)及飼料利用的影響如表3所示，脂肪水平和黃連素對(duì)花鱸的生長(zhǎng)性能有顯著影響(P<0.05)，但無(wú)顯著交互作用(P>0.05)。HFD組魚體的末體重、增重率、特定生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)顯著高于LFD組(P<0.05)；在LFD或HFD組飼料中添加黃連素均顯著降低了魚體的末體重、增重率、特定生長(zhǎng)率、飼料系數(shù)和蛋白質(zhì)效率(P<0.05)，說(shuō)明黃連素對(duì)魚體生長(zhǎng)有一定的副作用。此外，各組間攝食量、肝體比和存活率均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 黃連素對(duì)花鱸生長(zhǎng)及飼料利用的影響Table 3 Effects of berberine on growth and feed utilization of L. maculatus

2.2 黃連素對(duì)花鱸脂肪沉積的影響

黃連素對(duì)花鱸脂肪沉積的影響如表4所示，與LFD組相比，HFD組花鱸的腹脂率、血清TG和TC的含量顯著升高(P<0.05)。然而，飼料中添加黃連素顯著降低了花鱸的腹脂率(P<0.05)。

表4 黃連素對(duì)花鱸脂肪沉積的影響Table 4 Effects of berberine on fat deposition of L. maculatus

2.3 黃連素對(duì)花鱸肝臟基因表達(dá)的影響

黃連素對(duì)花鱸肝臟脂肪分解相關(guān)基因表達(dá)的影響如圖1所示。肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 Ⅰ(CPTⅠ)、乙酰輔酶 A 氧化酶(AOX)、過(guò)氧化物酶體增殖受體 α(PPARα)和脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)均是與脂肪分解相關(guān)的基因。與LFD組相比，HFD組AOX和PPARα基因相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)、CPTⅠ基因相對(duì)表達(dá)量有下調(diào)的趨勢(shì)但差異不顯著(P>0.05)。與HFD組相比，飼料中添加黃連素后顯著上調(diào)了CPTⅠ、AOX、PPARα和ATGL基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

黃連素對(duì)花鱸肝細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響如圖2所示。與LFD組相比，HFD組的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase9)和Bcl2 關(guān)聯(lián) X 蛋白(Bax)的基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。與HFD組相比，飼料中添加黃連素后顯著下調(diào)了Caspase3和Bax基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

2.4 黃連素對(duì)花鱸脂肪組織基因表達(dá)的影響

黃連素對(duì)花鱸脂肪組織凋亡基因表達(dá)的影響如圖3所示。與LFD組相比，HFD組Bax的基因相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。飼料中添加黃連素后顯著上調(diào)了Caspase9和Bax的基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

黃連素對(duì)花鱸脂肪組織自噬基因表達(dá)的影響如圖4所示。與LFD組相比，HFD組的PTEN 誘導(dǎo)激酶1(PINK1)、自噬相關(guān)基因5(Atg5)和線粒體E3 泛素連接酶1(Mul1)的基因相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，飼料中添加黃連素后則上調(diào)了PINK1和Atg5的基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

3 討 論

脂肪是魚類重要營(yíng)養(yǎng)素，飼料中脂肪不足會(huì)影響魚體的生長(zhǎng)，還會(huì)導(dǎo)致必需脂肪酸缺乏癥[7-8]。適當(dāng)?shù)奶岣唢暳现兄镜暮坑欣诖龠M(jìn)魚體的生長(zhǎng)，本試驗(yàn)結(jié)果也表明，將飼料中的脂肪含量提高到14%顯著提高了花鱸的增重率。然而過(guò)高的脂肪水平也會(huì)對(duì)魚體產(chǎn)生一些不利的影響，會(huì)出現(xiàn)脂肪過(guò)度沉積等現(xiàn)象[9-11]。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼料會(huì)導(dǎo)致軍曹魚腹腔和肌肉脂肪沉積。凌仕誠(chéng)[13]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量的脂肪會(huì)導(dǎo)致黃顙魚腸系膜脂肪沉積。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，HFD組花鱸腹部脂肪沉積提高。

研究表明，黃連素可以降低機(jī)體脂肪沉積[14]。為了緩解高脂飼料導(dǎo)致的魚體脂肪過(guò)度沉積，本試驗(yàn)探究飼料中添加黃連素對(duì)花鱸生長(zhǎng)及脂肪沉積的影響。由生長(zhǎng)性能的數(shù)據(jù)看出，相較于HFD組，添加黃連素顯著降低了花鱸的增重率。各組的攝食量變化不大，因此，黃連素降低花鱸增重率的原因并非是通過(guò)影響攝食，可能是通過(guò)促進(jìn)分解代謝、增加能量消耗而導(dǎo)致的。

CPTⅠ：肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ carnitine palmitoyl transferase Ⅰ；AOX:乙酰輔酶A氧化酶 acetyl-coa oxidase；PPARα：過(guò)氧化物酶體增殖受體α peroxisome proliferators activated receptor alpha；ATGL：脂肪甘油三酯脂肪酶 adipose triglyceride lipase。

Caspase3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 cysteinyl aspartate specific proteinase 3；Caspase9：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9 cysteinyl aspartate specific proteinase 9；Bax：Bcl2關(guān)聯(lián)X蛋白 Bcl2-associated X；Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤-2 B-cell lymphoma-2。下圖同 the same as below。

圖3 腹脂中凋亡相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)Fig.3 Relative expression of apoptosis related genes in abdominal fat

陳青青[4]在團(tuán)頭魴上的研究表明黃連素具有促進(jìn)脂肪分解代謝的作用，與本試驗(yàn)所得到的高脂飼料中添加黃連素后花鱸脂肪沉積顯著降低結(jié)果相似。因此，本研究探討了黃連素對(duì)花鱸肝臟脂肪代謝的影響。結(jié)果表明，高脂飼料會(huì)下調(diào)AOX和PPARa的基因相對(duì)表達(dá)量，而添加黃連素之后顯著上調(diào)了CPTⅠ、AOX、PPARa和ATGL的基因相對(duì)表達(dá)量。CPTⅠ是脂肪酸β-氧化過(guò)程中的限速酶，對(duì)脂肪代謝具有重要的調(diào)控作用，其表達(dá)水平升高有助于脂肪分解代謝，降低脂肪沉積[15-16]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體家族成員PPARα是CPTⅠ的上游調(diào)控因子[17]，PPARα可通過(guò)調(diào)控CPTⅠ來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[18]。這與在團(tuán)頭魴[19]中的研究結(jié)果一致，說(shuō)明黃連素可能通過(guò)上調(diào)PPARα基因相對(duì)表達(dá)量，從而調(diào)節(jié)CPTⅠ的表達(dá)加快脂肪氧化分解，最終緩解了脂肪沉積。AOX是過(guò)氧化物酶體β-氧化的限速酶，有研究表明，AOX活性降低導(dǎo)致過(guò)氧化物酶體β-氧化速率下降[20]；ATGL是甘油三酯水解的限速酶，是催化甘油三酯第1步水解的重要酶，在脂肪分解中發(fā)揮著重要的作用[21]。在本試驗(yàn)中，黃連素的添加可能是通過(guò)提高CPTⅠ、PPARα、AOX的活性，從而提高脂肪酸的氧化速率，并且促進(jìn)了TG的降解，從而緩解脂肪的沉積。這也提示了黃連素可能會(huì)增加機(jī)體對(duì)能量的消耗，而使得體重降低。

PINK1：PTEN誘導(dǎo)激酶1 PTEN induced putative kinase 1；Atg5：自噬相關(guān)基因5 autophagy related gene 5； Mul1：線粒體E3泛素連接酶1 mitochondrial E3 ubiquitin ligase 1。

肝臟脂肪的過(guò)度沉積往往會(huì)損傷肝細(xì)胞，常導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡[22-23]。凋亡主要包括外源性的死亡受體途徑和內(nèi)源性的線粒體途徑，Caspase等蛋白水解酶是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要效應(yīng)因子，Caspase可在線粒體途徑中被激活而誘發(fā)凋亡，因此Caspase被稱之為促凋亡因子[24]。本試驗(yàn)結(jié)果可知，高脂飼料組花鱸肝臟Caspase3、Caspase9和Bax的基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，說(shuō)明HFD組肝細(xì)胞的凋亡被激活，肝細(xì)胞凋亡增多。而添加黃連素后，花鱸肝臟Caspase3和Bax的基因相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，說(shuō)明黃連素緩解了高脂飼料導(dǎo)致的花鱸肝細(xì)胞凋亡，起到了保護(hù)肝細(xì)胞的作用。

由本研究可知，黃連素有效降低了花鱸腹脂的含量。因此，本試驗(yàn)還探討了黃連素降低腹脂的分子機(jī)制。結(jié)果表明，高脂飼料可以顯著降低脂肪細(xì)胞的凋亡和自噬相關(guān)基因的表達(dá)。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)可知，脂肪細(xì)胞凋亡后導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的總數(shù)減少了，從而導(dǎo)致脂肪沉積的減少[25-26]。此外，高脂飼料可以顯著降低脂肪細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá)。細(xì)胞自噬是一種真核生物中高度保守的代謝過(guò)程，可降解脂類等生物大分子物質(zhì)以供細(xì)胞重新利用[27]。因此，自噬深度參與脂肪細(xì)胞的細(xì)胞分化與能量代謝，若自噬被抑制會(huì)導(dǎo)致脂肪的沉積，被激活則脂肪沉積會(huì)減少。在本試驗(yàn)研究中，HFD組添加黃連素后提高了PINK1和Atg5基因相對(duì)表達(dá)量。PINK1被認(rèn)為是線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)的分子開關(guān)，參與線粒體自噬調(diào)控過(guò)程[28]；Atg5是形成自噬復(fù)合體的關(guān)鍵基因，影響細(xì)胞自噬活性，對(duì)細(xì)胞的自噬調(diào)控有著重要作用。有研究表明，敲除或沉默Atg5可導(dǎo)致脂肪沉積的發(fā)生[29]。因此，高脂飼料抑制了花鱸脂肪細(xì)胞的自噬，而黃連素的添加激活了脂肪細(xì)胞的自噬，最終緩解了脂肪的沉積。

4 結(jié) 論

綜上所述，高脂飼料會(huì)導(dǎo)致花鱸的脂肪過(guò)度沉積并損傷肝細(xì)胞，添加黃連素通過(guò)促進(jìn)脂肪細(xì)胞的凋亡與自噬而緩解脂肪沉積，且黃連素還可以上調(diào)肝臟脂肪分解基因的表達(dá)，從而促進(jìn)了脂肪分解；但黃連素會(huì)降低花鱸的生長(zhǎng)速度和飼料轉(zhuǎn)化率。