王青云 郭穩(wěn)杰 成為為 鄧國(guó)喬 徐洪亮 夏儒龍

(1 武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢 430207；2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070)

瓦氏黃顙魚(yú)(Pelteobagrusvachellii)隸屬于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黃顙魚(yú)屬(Pelteobagrus)，是黃顙魚(yú)屬中個(gè)體最大、生長(zhǎng)最快的類群，主要分布于長(zhǎng)江及其支流中[1]。該魚(yú)因肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、少肌間刺、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)而備受消費(fèi)者的青睞[2]。但是近些年，由于生境惡化和過(guò)度捕撈等原因，瓦氏黃顙魚(yú)野生資源遭到嚴(yán)重破壞，其種質(zhì)資源也面臨巨大威脅[3]。良種選育是我國(guó)瓦氏黃顙魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康與可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要內(nèi)容之一，而在良種選育過(guò)程中，對(duì)其遺傳多樣性和系譜信息的掌握是至關(guān)重要的。

微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite)又稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeats，SSR)，因具有共顯性、多態(tài)性豐富、遵循孟德?tīng)栠z傳、易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛用于群體遺傳學(xué)[4]、親子鑒定[5]、遺傳圖譜構(gòu)建[6]和基因定位研究[7]等領(lǐng)域。近年來(lái)，新一代高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法的發(fā)展，使得低廉且高效地獲得SSR標(biāo)記序列成為可能。目前已利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黃顙魚(yú) (Pelteobagrusfulvidraco)[8]、莖柔魚(yú)(Dosidicusgigas)[9]、大刺鰍 (Mastacembelusarmatus)[10]等物種進(jìn)行了SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。本研究采用RAD(restriction association site DNA)簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)瓦氏黃顙魚(yú)的SSR標(biāo)記，以期為瓦氏黃顙魚(yú)分子標(biāo)記輔助育種提供可用的分子標(biāo)記。

1 材料和方法

1.1 瓦氏黃顙魚(yú)樣本采集

研究所用的30個(gè)瓦氏黃顙魚(yú)樣本全部采自長(zhǎng)江武漢段，剪取部分魚(yú)的尾鰭后將其放生，尾鰭樣本用無(wú)水酒精固定后于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆??；蚪MDNA采用TIANGEN[天根生化科技(北京)有限公司]試劑盒提取。

1.2 RAD文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

隨機(jī)選取8個(gè)瓦氏黃顙魚(yú)樣本送交廣州基迪奧生物科技有限公司構(gòu)建RAD簡(jiǎn)化基因組文庫(kù)，采用Illumina Hiseq 2500進(jìn)行測(cè)序。

1.3 SSR位點(diǎn)鑒別

將8個(gè)樣品的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，拼接組裝獲得contig序列后，使用軟件MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對(duì)所有contig序列進(jìn)行SSR鑒別，鑒別標(biāo)準(zhǔn)為2、3、4、5、6堿基的重復(fù)次數(shù)至少為6、5、4、4、4。

1.4 SSR引物設(shè)計(jì)與多態(tài)性篩選

鑒定出的SSR位點(diǎn)采用primer 3引物設(shè)計(jì)工具(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)進(jìn)行批量設(shè)計(jì)。隨機(jī)挑選25對(duì)SSR重復(fù)次數(shù)相對(duì)較多的引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行合成。

用8個(gè)瓦氏黃顙魚(yú)DNA模板對(duì)合成引物進(jìn)行初步篩選和條件優(yōu)化，優(yōu)化后的引物進(jìn)行熒光標(biāo)記后以30個(gè)個(gè)體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳進(jìn)行多態(tài)性篩選。PCR反應(yīng)體系包括：2×PCR Mix 10 μL，DNA模板1 μL(50 ng/μL)，5 mmol/L引物對(duì)各0.5 μL，超純水8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)34次；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司采用ABI 3730XL進(jìn)行基因型分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

根據(jù)統(tǒng)計(jì)的基因型數(shù)據(jù)，用PopGen 32軟件[11]計(jì)算微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因數(shù)(Na)；采用MS-TOOLS[12]分析觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)及多態(tài)信息含量 (polymorphic information content，PIC)；用ARLEQUIN version 3.1 軟件[13]檢測(cè)各位點(diǎn)是否偏離哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)。

2 結(jié)果

2.1 瓦氏黃顙魚(yú)RAD簡(jiǎn)化基因組SSR分析

序列組裝和拼接后共獲得2 275 778條contig序列，利用MISA對(duì)所得的contig序列進(jìn)行微衛(wèi)星片段搜索，共檢測(cè)到466 983個(gè)SSR位點(diǎn)，其中二堿基重復(fù)位點(diǎn)最多(335 095個(gè))，主要是AC/GT(占49.8%)，其次是四堿基重復(fù)位點(diǎn)(84 703個(gè))，主要是AATG/CATT(占3.9%)；剩余依次是三堿基重復(fù)位點(diǎn)(31 271個(gè))、五堿基重復(fù)位點(diǎn)(13 661個(gè))和六堿基重復(fù)位點(diǎn)(2 253個(gè))。相關(guān)信息詳見(jiàn)圖1和表1。

圖1 SSR重復(fù)單元分類和分布頻率統(tǒng)計(jì)Fig.1 Characterization and frequency of microsatellites with different motif sizes

表1 微衛(wèi)星重復(fù)類型統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Statistics information of microsatellites with different motif sizes

2.2 瓦氏黃顙魚(yú)SSRs多態(tài)性篩選和檢測(cè)

本研究從被篩選出的結(jié)果中隨機(jī)選取SSR重復(fù)次數(shù)相對(duì)較多的25對(duì)引物，對(duì)武漢江段8個(gè)瓦氏黃顙魚(yú)DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)優(yōu)化后，有19對(duì)引物能較好地?cái)U(kuò)增出產(chǎn)物，且產(chǎn)物大小與預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小一致。用30個(gè)瓦氏黃顙魚(yú)樣本對(duì)擴(kuò)增出目標(biāo)產(chǎn)物的引物進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證，其中13個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)出多態(tài)性(見(jiàn)表2)。

表2 瓦氏黃顙魚(yú)多態(tài)性微衛(wèi)星引物序列信息Tab.2 Information of polymorphic microsatellite markers isolated from Pelteobagrus vachelli

13個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到184個(gè)等位基因，各位點(diǎn)等位基因數(shù)(Na)在11～21個(gè)，平均為14.2個(gè)；各位點(diǎn)觀察雜合度(Ho)在0.700～1.00，平均為0.874；期望雜合度(He)在0.871～0.933，平均為0.905；平均多肽信息含量(PIC)為0.880，所有位點(diǎn)均屬于高多態(tài)性位點(diǎn)(PIC>0.5)。除位點(diǎn)PV6和PV7顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(0.01

3 討論

傳統(tǒng)SSR開(kāi)發(fā)方法往往需要構(gòu)建基因組富集文庫(kù)、雜交篩選和測(cè)序等步驟，過(guò)程比較耗時(shí)費(fèi)力，如今高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展以及成本的急劇降低為SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)創(chuàng)造了較好的條件，該技術(shù)具有開(kāi)發(fā)周期短、得率高、靈活性好等優(yōu)點(diǎn)[14]。近年來(lái)，利用RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的技術(shù)日益成熟，相關(guān)研究報(bào)道也越來(lái)越多。劉連為等[9]對(duì)莖柔魚(yú)(D.gigas)進(jìn)行了RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，覆蓋度為2X，結(jié)果表明，可進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的SSR位點(diǎn)有5 177個(gè)，在隨機(jī)合成的100對(duì)引物中，有60對(duì)引物擴(kuò)增出清晰條帶，其中39對(duì)引物擴(kuò)增出的條帶呈現(xiàn)多態(tài)性。屈政委等[15]采用RAD-seq對(duì)印尼虎魚(yú)(Datnioidespulcher)進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，經(jīng)序列分析，共檢測(cè)到26 359個(gè)SSR位點(diǎn)，并成功開(kāi)發(fā)出20個(gè)多態(tài)性的SSR位點(diǎn)。本研究通過(guò)分析瓦氏黃顙魚(yú)RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，共鑒定出466 983個(gè)SSR位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上，后續(xù)所要做的工作相對(duì)比較簡(jiǎn)單，只需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢驗(yàn)其是否具有多態(tài)性即可。因此，基于RAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序進(jìn)行SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)具有很好的應(yīng)用前景。

目前已報(bào)道的瓦氏黃顙魚(yú)SSR標(biāo)記數(shù)量很少，均來(lái)自同屬黃顙魚(yú)的跨種擴(kuò)增[16]，尚未見(jiàn)到基于高通量測(cè)序技術(shù)大量開(kāi)發(fā)瓦氏黃顙魚(yú)SSR標(biāo)記的報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)瓦氏黃顙魚(yú)RAD簡(jiǎn)化基因組序列進(jìn)行分析，共設(shè)計(jì)出了414 484對(duì)符合引物開(kāi)發(fā)條件的SSR候選引物。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)引物的開(kāi)發(fā)質(zhì)量及開(kāi)發(fā)效率，利用熒光PCR毛細(xì)管電泳對(duì)其中25對(duì)引物進(jìn)行了電泳檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，在25對(duì)引物中，有13對(duì)為多態(tài)性引物，且均為高多態(tài)性引物(PIC>0.5)[17]，這可能與選擇的SSR重復(fù)次數(shù)相對(duì)較多有關(guān)。這13個(gè)具有高度多態(tài)性的位點(diǎn)今后可直接應(yīng)用于瓦氏黃顙魚(yú)群體遺傳學(xué)、親子鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等方面研究中。