趙慧婷，彭 竹，黃 麗，郭麗娜，杜亞麗，呂建華

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，昆蟲與外界環(huán)境相互作用，形成了復(fù)雜且靈敏的化學(xué)感受系統(tǒng)(如嗅覺和味覺系統(tǒng))，在昆蟲覓食、飼喂、交配、個(gè)體交流及躲避敵害等行為中發(fā)揮了重要的作用。在參與昆蟲嗅覺識(shí)別的多種蛋白中，包含一類小分子量的親水性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白——?dú)馕督Y(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)。這類蛋白存在于昆蟲嗅覺感受器的淋巴液中，其主要功能是結(jié)合和運(yùn)輸外界疏水性的氣味分子到達(dá)嗅覺神經(jīng)元樹突狀膜上，激活膜上的氣味受體ORs(odorant receptors, ORs)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生行為反應(yīng)(Lealetal., 2013; Pelosietal., 2018)。因此，從嗅覺發(fā)生的過程可以看出，OBPs在識(shí)別氣味分子和引發(fā)生理反應(yīng)的途徑中起到了十分重要的作用(Danietal., 2011)。

Vogt等(1981)利用傳統(tǒng)的配體結(jié)合試驗(yàn)手段，從多音天蠶蛾Antheraeapolyphemus觸角中鑒定到昆蟲第一個(gè)OBP蛋白。近年來，高通量技術(shù)的興起加速了昆蟲OBPs基因的鑒定。而基因的表達(dá)特性常常與其功能存在著密切的聯(lián)系，當(dāng)基因被鑒定后，其表達(dá)譜的研究成為了一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作。Forêt和Maleszka(2006)在西方蜜蜂Apismellifera基因組中共鑒定到21個(gè)OBPs，其中的9個(gè)基因在觸角中特異性表達(dá)，其余基因在各個(gè)組織或特異的組織中表達(dá)。其后，Iovinella等(2011)對(duì)21個(gè)OBPs在西方蜜蜂不同級(jí)型和不同發(fā)育期下頜腺中的表達(dá)特性及氣味分子結(jié)合能力進(jìn)行了研究，推測(cè)在下頜腺中高表達(dá)的OBPs可能參與了化學(xué)信息素的溶解與釋放過程。

盡管昆蟲OBPs起初多被證實(shí)為具有嗅覺功能，而且這類蛋白大多數(shù)表達(dá)在昆蟲的觸角中，然而隨著OBPs基因家族成員不斷被鑒定，越來越多的研究表明，OBPs除具有嗅覺功能外，還有結(jié)合其他配體等更廣泛的生理功能，如在昆蟲頭部和足部表達(dá)的OBPs可能與味覺識(shí)別有關(guān)(Pelosietal., 2014)；在黑庫蚊Culexnigripalpus和錐蝽Rhodniusprolixus的腸道轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的OBPs，被認(rèn)為可能參與了轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或其它與腸道功能有關(guān)的分子(Smartt and Erickson, 2009; Ribeiroetal., 2014)。另外，在昆蟲產(chǎn)生信息素的腺體和生殖器官中也發(fā)現(xiàn)了OBP基因，如棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHübnerOBP10(Sunetal., 2012)和埃及伊蚊Aedesaegypti的OBP22(Lietal., 2008)，它們可能參與控制化學(xué)信息素向環(huán)境中釋放的過程。

蜜蜂作為一類社會(huì)性昆蟲具有很高的化學(xué)感知和通訊能力。頭部是蜜蜂感覺和取食的中心，著生有眼、觸角和口器，蜜蜂通過感知蜂群內(nèi)部的信息素來調(diào)節(jié)和穩(wěn)定蜂群高度復(fù)雜的社會(huì)活動(dòng)，通過監(jiān)測(cè)外界環(huán)境中的氣味化合物來定位食物來源(Slessoretal., 2005)。為了進(jìn)一步挖掘意大利蜜蜂OBPs的序列特征及其表達(dá)譜數(shù)據(jù)，在前人研究基礎(chǔ)上，本研究分析了21個(gè)OBPs基因在意大利蜜蜂Apismelliferaligustica不同日齡內(nèi)勤蜂頭部的表達(dá)模式，該試驗(yàn)結(jié)果也為研究昆蟲OBPs更廣泛的生理功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品的準(zhǔn)備

意大利蜜蜂于2018年夏季采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)。從3箱蜂群中分別提取正有新蜂出房的封蓋子脾，置于恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件為：溫度34℃±1℃，相對(duì)濕度75%±5%。次日，每箱中收集1日齡工蜂各10頭。同時(shí)使用標(biāo)記筆在新蜂胸背部進(jìn)行標(biāo)記，一群蜂標(biāo)記約100頭，標(biāo)記后將巢脾帶蜂放回原群中。此后，分別于4、6、8、10、12和14日齡從3群蜂中各采集10頭工蜂，用無菌鑷子將工蜂頭部分離下來，迅速投入液氮冷凍后研磨，盛入裝有1 mL Trizol的EP管中，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取及cDNA合成

按照Trizol試劑盒(Invitrogen, USA)說明書提取各樣品的總RNA。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳和核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA的完整性及其純度和濃度后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, 中國(guó)大連)進(jìn)行cDNA第一鏈合成。合成過程分兩步：①基因組DNA的去除。反應(yīng)總體系為10 μL：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，總RNA 1 μg，RNase Free ddH2O補(bǔ)足10 μL。42℃孵育2 min；②反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)總體系為10 μL：5×Primer Script Buffer 4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，步驟①的反應(yīng)液10 μL。37℃ 15 min，85℃ 5 s。

1.3 引物設(shè)計(jì)

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索意大利蜜蜂21個(gè)OBPs基因的核苷酸序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，用于RT-PCR及qPCR試驗(yàn)。由于OBP6與OBP8、OBP19與OBP20核苷酸序列相似性很高，分別為96%和99%，通過PCR擴(kuò)增難以將其區(qū)分開來，因此這兩對(duì)基因分別共用一對(duì)引物。引物詳情見附表1。

1.4 RT-PCR檢測(cè)OBPs在工蜂頭部組織的表達(dá)

采用RT-PCR方法檢測(cè)21個(gè)OBPs在8日齡工蜂頭部組織的表達(dá)量。PCR擴(kuò)增總體系為20 μL：1×Taq MasterMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8 min。以西方蜜蜂Arp1(GenBank登錄號(hào)：XM_623831.6)為參照基因。

1.5 qPCR檢測(cè)部分OBPs在不同日齡工蜂頭部的表達(dá)量

以意大利蜜蜂Arp1為內(nèi)參基因，在7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI)中采用SYBR Green法進(jìn)行qPCR檢測(cè)。熒光定量PCR總體系為20 μL：cDNA各1.5 μL，SYBRPremixExTaq(2×)10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；接著進(jìn)行42個(gè)循環(huán)反應(yīng)，循環(huán)條件為95℃ 5 s，60℃ 30 s。測(cè)定溶解曲線的反應(yīng)條件為：95℃ 15 s，60℃ 1 min。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.6 21個(gè)OBPs氨基酸序列的Motif分析

利用在線軟件MEME 5.2.0(http://meme-suite.org/tools/meme)對(duì)21條完整的OBPs氨基酸序列進(jìn)行保守基序Motif預(yù)測(cè)分析，設(shè)置的保守Motif最大數(shù)目為6。通過Pfam 33.1(http://pfam.xfam.org/)在線分析軟件對(duì)Motif進(jìn)行功能注釋。

1.7 數(shù)據(jù)分析

對(duì)于qPCR檢測(cè)數(shù)據(jù)，根據(jù)擴(kuò)增曲線獲得的Ct值，在Excel中采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，并利用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 意大利蜜蜂OBPs基因家族的Motif預(yù)測(cè)結(jié)果

對(duì)21個(gè)意大利蜜蜂OBPs基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行Motif預(yù)測(cè)分析，得到6個(gè)保守的Motif(圖1)。Pfam分析結(jié)果表明，Motif 1和Motif 6均為PBP/GOBP family典型結(jié)構(gòu)，其余Motif均未得到其功能結(jié)構(gòu)的信息。Motif 4最短，包含15個(gè)氨基酸，Motif 6最長(zhǎng)，由50個(gè)氨基酸組成。在所有的OBPs的氨基酸序列中都存在Motif 1(圖2)，可見Motif 1是意大利蜜蜂氣味結(jié)合蛋白家族十分保守的基序，且該基序中包含一個(gè)保守的半胱氨酸殘基。另外，在13個(gè)OBPs中含有Motif 2，11個(gè) OBPs中含有Motif 3，9個(gè)OBPs中含有Motif 4，7個(gè)OBPs中含有Motif 5，僅有2個(gè)OBPs中含有Motif 6。從Motif排布位置來看，Motif 4和Motif 5的位置較為固定，Motif 4位于第1～15位aa，Motif 5位于第75～95位aa。

圖1 意大利蜜蜂OBPs的Motif結(jié)構(gòu)類型

圖2 意大利蜜蜂OBPs Motif的組成及排布

對(duì)Motif的結(jié)構(gòu)和分布進(jìn)行對(duì)比分析，可以將21個(gè)OBPs分為4種類型，OBP15～OBP21均含有相同的5個(gè)Motif(Motif 1～Motif 5)，且Motif的排布位置一致，而OBP13和OBP14的Motif結(jié)構(gòu)與之相似，因此可以將它們歸為一類；OBP6和OBP8的結(jié)構(gòu)相似，在其氨基酸序列中Motif 3、Motif 1和Motif 6依次排列；OBPs 1、9、10和11均含有兩個(gè)Motif(Motif 1和Motif 2)；OBPs 2、3、4、5、7和12僅含有1個(gè)Motif(Motif 1)。

2.2 OBPs在意大利蜜蜂工蜂頭部表達(dá)量的定性分析

利用RT-PCR檢測(cè)了各OBPs在4日齡意大利工蜂頭部的表達(dá)量，RCR擴(kuò)增后的凝膠電泳結(jié)果見圖3。由圖可見，內(nèi)參基因Arp1的擴(kuò)增條帶(A圖第10泳道，B圖第11泳道)清晰，無拖尾，說明模板cDNA質(zhì)量良好，可以通過電泳條帶的亮度初步判斷目的基因的表達(dá)量。圖3中，OBPs1-5、6/8、10、14、15、17、18、19/20和21的條帶較亮，表明這13個(gè)基因在意大利蜜蜂工蜂頭部均有表達(dá)，而OBPs7、9、11、12、13和16的條帶較弱，說明這6個(gè)基因在工蜂頭部表達(dá)量較低，因此未參與后續(xù)qPCR試驗(yàn)。

圖3 21個(gè)OBPs在工蜂頭部組織RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 部分OBPs在意大利蜜蜂工蜂頭部表達(dá)量的定量分析

對(duì)RT-PCR試驗(yàn)篩選出的13個(gè)擴(kuò)增條帶較亮，即在內(nèi)勤蜂頭部表達(dá)量較高的OBPs基因，進(jìn)一步利用qPCR進(jìn)行定量檢測(cè)分析。

首先，以O(shè)BP3基因mRNA表達(dá)量為基準(zhǔn)，分析了13個(gè)OBP基因在4日齡和8日齡工蜂頭部的相對(duì)表達(dá)量。從兩個(gè)表達(dá)譜綜合分析結(jié)果可以看出，OBPs1、2、4、6/8和21在工蜂頭部的表達(dá)量較高，而OBPs5、10和19的表達(dá)量相對(duì)較低(如圖4所示)。qPCR結(jié)果中大部分基因的表達(dá)情況與RT-PCR的結(jié)果相符。

圖4 13個(gè)OBPs基因在工蜂頭部組織的表達(dá)量

其次，以各基因8日齡mRNA的表達(dá)量為基準(zhǔn)，對(duì)13個(gè)OBPs在內(nèi)勤蜂不同發(fā)育階段(1～14日齡)基因表達(dá)量的變化進(jìn)行了分析(見圖5)。值得注意的是，在13個(gè)OBPs中，大多數(shù)基因(11個(gè)OBPs)均是在4日齡時(shí)表達(dá)量最高。其中，OBPs15、17、18、19/20和21的表達(dá)模式相似，即1日齡表達(dá)量最低，4日齡表達(dá)量最高，6日齡、8日齡的表達(dá)量依次降低，10日齡、12日齡和14日齡表達(dá)量再次降低，但3者間差異不顯著；OBPs2、3、5和OBP6/8的表達(dá)模式相似，即1日齡表達(dá)量最低，4日齡表達(dá)量最高，6～14日齡表達(dá)量差異不大；OBP1和OBP4表達(dá)模式相似，即4日齡表達(dá)量最高，1日齡次之，其余日齡表達(dá)量均較低，14日齡表達(dá)量最低。OBP10和OBP14的表達(dá)情況較為特殊，OBP10在1日齡時(shí)表達(dá)量最高，隨日齡的增加表達(dá)量逐漸降低；OBP14在6日齡時(shí)表達(dá)量較高，10～12日齡表達(dá)量較低。

圖5 13個(gè)OBPs在不同日齡工蜂頭部組織的表達(dá)模式

3 結(jié)論與討論

蜜蜂同其它社會(huì)性昆蟲類似，利用自身復(fù)雜的化學(xué)通訊系統(tǒng)，調(diào)節(jié)不同性別、不同級(jí)型和不同群體間的關(guān)系，以及同一群體內(nèi)不同個(gè)體間的分工合作(Slessoretal., 2005)。另外，蜜蜂還能夠識(shí)別與其有親屬的關(guān)系的其它個(gè)體，單倍體的雄蜂和病死的個(gè)體(Swansonetal., 2009)。昆蟲化學(xué)感受過程中涉及許多不同種類的蛋白，如氣味結(jié)合蛋白(OBPs)、化學(xué)感受蛋白(CSPs)、氣味受體(ORs)、神經(jīng)元膜蛋白(SNMPs)和氣味降解酶(ODEs)等，這些蛋白將結(jié)合的化學(xué)配體的信息傳遞給中樞神經(jīng)產(chǎn)生行為反應(yīng)。研究已證實(shí)，在昆蟲觸角中高表達(dá)的OBPs主要行使嗅覺功能(Lealetal., 2013; Qiuetal., 2018)，而目前的一個(gè)重要任務(wù)是解析在其它組織中廣泛表達(dá)的OBPs的非嗅覺功能。

蜜蜂的OBPs共有21個(gè)家族成員，其數(shù)量比黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(52個(gè))、岡比亞按蚊Anophelesgambiae(69個(gè))、德國(guó)小蠊Blattellagermanica(109個(gè))少很多(Hekmat-Scafeetal., 2002; Vieira and Rozas, 2011; Robertsonetal., 2018)，但與同屬于社會(huì)性昆蟲的火紅蟻Solenopsisinvicta的數(shù)量(18個(gè))相近(Gotzeketal., 2011)，屬于小型的基因家族，然而這也為系統(tǒng)地研究這一家族的進(jìn)化及功能提供了有利的條件。目前，已開展了對(duì)蜜蜂OBPs的表達(dá)(Forêt and Maleszkaetal., 2006; 杜亞麗等，2016；2019)、結(jié)構(gòu)(Lartigueetal., 2004；Spinellietal., 2012)、與氣味分子的結(jié)合能力及結(jié)合位點(diǎn)(Langeswaranetal., 2018; Songetal., 2018)等方面的研究。

Motif通常是一些有序列特異性蛋白的結(jié)合位點(diǎn)的短序列，與基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān)。通過對(duì)意大利蜜蜂21條OBPs氨基酸序列中6個(gè)Motif進(jìn)行比較分析得出，Motif 1是21個(gè)OBPs所共有的基序結(jié)構(gòu)，推測(cè)這一Motif很可能與底物的結(jié)合密切相關(guān)。Motif 6僅在OBP6和OBP8中存在，這一基序是否與底物結(jié)合的特異性有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。另外，從21個(gè)OBPs的Motif組成及排布來看，OBPs 13～21的Motif結(jié)構(gòu)相似，OBP6和OBP8的結(jié)構(gòu)相似，這一結(jié)果與Forêt和Maleszka(2006)采用neighbor-joining 法建立的蜜蜂OBPs系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果類似。但是在進(jìn)化樹中OBP5與OBP6和OBP8被歸為一個(gè)分支，與本研究的歸類結(jié)果不一致，對(duì)其具體功能的分類還需要更進(jìn)一步的試驗(yàn)支持。

Forêt和Maleszka(2006)利用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)(Reverse Northern dot blot hybridization)分析了西方蜜蜂OBPs在不同級(jí)型、不同組織和不同發(fā)育階段(幼蟲、蛹、1日齡幼蜂和采集蜂)的表達(dá)量，結(jié)果顯示，除OBP10和OBP14外，其余基因在頭部表達(dá)量均較低。而本研究分析結(jié)果表明，除OBPs7、9、11、13和16在工蜂頭部表達(dá)量較弱外，其余OBP基因均有表達(dá)，且OBPs1、2、4、6/8和21表達(dá)量較高。造成兩研究結(jié)果差異的原因可能是由于試驗(yàn)方法不同，通常RT-PCR和qPCR檢測(cè)方法比Northern印跡更加靈敏，因此得到的表達(dá)量也不盡相同。

不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)譜分析表明，在意大利內(nèi)勤蜂頭部有表達(dá)的OBPs中，多數(shù)在4日齡表達(dá)量較高，6日齡后表達(dá)量均較低，推測(cè)這些OBPs可能具有類似的功能。在正常的蜂群中，3～6日齡的工蜂主要承擔(dān)調(diào)制蜂糧飼喂大幼蟲的工作；6～12日齡工蜂王漿腺發(fā)達(dá)，可分泌大量王漿，從事飼喂小幼蟲、蜂王等工作；12～18日齡的工蜂蠟腺發(fā)達(dá)，可從事泌蠟造脾、清潔衛(wèi)生、釀蜜等工作(曾志將，2017)。頭部是蜜蜂感覺和取食的中心，在其表面分布著大量的嗅覺和味覺感受器(Matsuoetal., 2007)。因此本研究推測(cè)在4日齡工蜂頭部表達(dá)量較高的OBPs可能參與了幼蟲信息素和糖類物質(zhì)的識(shí)別。

本研究對(duì)意大利蜜蜂氣味結(jié)合蛋白OBPs基因家族的氨基酸序列進(jìn)行Motif分析，鑒定到一個(gè)十分保守的Motif結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為21個(gè)氨基酸，包含一個(gè)保守的半胱氨酸殘基。21個(gè)OBPs基因中有13個(gè)在內(nèi)勤蜂頭部有表達(dá)，其中OBPs1、2、4、6/8和21表達(dá)量相對(duì)較高，且大多數(shù)基因在4日齡時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，這些OBPs可能參與了意大利蜜蜂對(duì)巢內(nèi)蜂糧等甜味物質(zhì)及幼蟲信息素的識(shí)別過程。