左 雪, 邸 錚, 杜 勇, 楊 玲, 張 蓉, 鄔國慶

(北京市藥品檢驗所, 北京 102206)

隨著居民生活水平的日益提升,我國染發(fā)類產(chǎn)品的市場需求也日趨增加。染發(fā)產(chǎn)品按作用機(jī)理可分為氧化型和非氧化型,其中氧化型為目前市場上銷售、使用的主要產(chǎn)品類型。氧化型染發(fā)產(chǎn)品中的染發(fā)劑主要包括芳香胺類及酚類化合物等,相關(guān)研究表明,此類化合物具有不同程度的致敏性、致突變性及其他毒性作用[1-4],可引發(fā)皮膚過敏等不良反應(yīng)[5-7],使該類產(chǎn)品的安全性備受關(guān)注。因此,針對氧化型染發(fā)產(chǎn)品中常見的染發(fā)劑,建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法,為產(chǎn)品的研發(fā)與監(jiān)管提供有效的技術(shù)手段,是十分必要的。

目前,包括液相色譜法[8-13]、液相色譜-質(zhì)譜法[14-18]、氣相色譜法[19]、氣相色譜-質(zhì)譜法[20,21]、離子色譜法[22]及毛細(xì)管電泳法[23]等在內(nèi)的多種技術(shù)手段均已應(yīng)用于染發(fā)劑的檢測。其中,液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法應(yīng)用最為廣泛,但質(zhì)譜儀器成本較高,且在分析復(fù)雜樣品及成分含量未知的樣品時,易造成離子源污染;液相色譜法適用于多種染發(fā)劑的分離分析,是一種比較理想的檢驗方法。查詢、統(tǒng)計國家藥品監(jiān)督管理局2016～2018年注冊的染發(fā)產(chǎn)品配方,并結(jié)合文獻(xiàn)[24]報道,發(fā)現(xiàn)目前氧化型染發(fā)產(chǎn)品中添加的準(zhǔn)用染發(fā)劑達(dá)四十余種?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版,簡稱《規(guī)范》)[25]中提供的對苯二胺等32種組分的法定檢驗方法及嚴(yán)巍等[26]建立的32種禁限用染發(fā)劑的液相色譜測定方法,均可實現(xiàn)32種禁用、準(zhǔn)用染發(fā)劑(其中包含24種準(zhǔn)用染發(fā)劑)的檢測,但需要同時建立3個液相色譜系統(tǒng)才能完成測定,儀器、色譜柱及試劑的消耗很大,且影響檢驗效率。近幾年,多篇研究[11,27-29]報道了采用單一液相色譜體系同時測定多種染發(fā)劑的檢測方法,方法較為簡便、高效,但最多可檢測不到30種染發(fā)劑。

本研究利用單一液相色譜系統(tǒng)建立了40種染發(fā)劑的定性、定量測定方法,其中包含36種準(zhǔn)用染發(fā)劑。與《規(guī)范》[25]相比,該方法大大簡化了液相色譜分析條件,并增加了1-羥乙基-4,5-二氨基吡唑硫酸鹽、羥乙基對苯二胺硫酸鹽、四氨基嘧啶硫酸鹽、2,6-二羥乙基氨甲苯、2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚、2-甲基-5-羥乙氨基苯酚、3-硝基對羥乙氨基酚、4-羥丙氨基-3-硝基苯酚、5-氨基-4-氯鄰甲酚、5-氨基-6-氯-鄰甲酚、HC黃2號、羥苯并嗎啉和羥乙基-2-硝基對甲苯胺等13種常見準(zhǔn)用染發(fā)劑,較大程度擴(kuò)充了染發(fā)劑檢測種類。與實驗室前期建立的、同時測定33種染發(fā)劑的液相色譜方法[30]相比,該方法通過改變流動相種類、增加柱溫變化等方式,進(jìn)一步提升了各染發(fā)劑的分離效果,彌補了1-羥乙基-4,5-二氨基吡唑硫酸鹽、四氨基嘧啶硫酸鹽、2-氨基-3-羥基吡啶和對苯二胺等大極性組分分離度不佳的問題;該方法補充了《規(guī)范》[25]方法含有、而實驗室前期建立方法中未包含的準(zhǔn)用染發(fā)劑苯基甲基吡唑啉酮,同時還增加了《規(guī)范》[25]與前期方法中均未包含的2,6-二羥乙基氨甲苯等10種準(zhǔn)用染發(fā)劑,實現(xiàn)了更多成分的有效分離與準(zhǔn)確定量,提升了方法在產(chǎn)品實際檢驗工作中的全面性與針對性;方法通過提取溶劑濃度優(yōu)化,進(jìn)一步提高了樣品提取率與檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。該方法為氧化型染發(fā)產(chǎn)品的高效、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確檢測以及更全面監(jiān)管提供了技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

1100型高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器(DAD),美國Agilent公司;CP225D型電子分析天平,德國Sartorius公司;KQ-500型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司。

1,5-萘二酚等14種染發(fā)劑對照品購自北京曼哈格生物科技有限公司,1-萘酚等13種染發(fā)劑對照品購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,2-氨基-6-氯-4-硝基苯酚等6種染發(fā)劑對照購自美國Sinco Pharmachem公司,2-甲基-5-羥乙氨基苯酚等3種染發(fā)劑對照品購自加拿大Toronto Research Chemicals公司,1-羥乙基-4,5-二氨基吡唑硫酸鹽等3種染發(fā)劑對照品購自美國Ark Pharm公司,四氨基嘧啶硫酸鹽購自北京百靈威科技有限公司。所有對照品純度均不低于95%。40種染發(fā)劑對照品信息詳見表1。

表 1 40種染發(fā)劑對照品的信息

乙腈(色譜純)購自德國Merck公司;Milli-Q超純水系統(tǒng)購自法國Millipore公司;乙酸銨(色譜純)購自美國Fisher Chemical公司;無水乙醇(優(yōu)級純)購自現(xiàn)代東方(北京)科技發(fā)展有限公司;亞硫酸氫鈉(分析純)購自北京化學(xué)試劑公司。

樣品均為市售氧化型染發(fā)產(chǎn)品,含染發(fā)膏和氧化乳兩種劑型,取其中染發(fā)膏供含量測定。

1.2 溶液配制

含70%乙醇的亞硫酸氫鈉水溶液:量取無水乙醇700 mL,置于1 000 mL量瓶中,加入2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液至刻度,充分振搖混勻,備用。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:稱取40種染發(fā)劑對照品各50 mg(精確至0.1 mg),置于同一50 mL棕色量瓶中,加入約40 mL含70%乙醇的亞硫酸氫鈉水溶液,超聲至充分溶解,再加入2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液至刻度,充分振搖混勻,即得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液:上述40種染發(fā)劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用2g/L亞硫酸氫鈉水溶液配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度分別為5、10、50、100、250和500 mg/L。所得溶液于5 ℃條件下保存。

1.3 樣品前處理

稱取染發(fā)產(chǎn)品中染發(fā)膏0.5 g(精確至0.001 g),置于25 mL比色管中,加入含70%乙醇的亞硫酸氫鈉水溶液至10 mL刻度,渦旋30～60 s至分散均勻,超聲提取15 min,放冷后加入2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液至25 mL刻度,渦旋30 s,充分振搖混勻。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,續(xù)濾液待測。

1.4 色譜條件

色譜柱為Waters Atlantis?T3 MV Kit柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動相:A相為0.02 mol/L乙酸銨水溶液(含4%乙腈), B相為乙腈;流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為5 μL。柱溫及梯度洗脫程序見表2。同時設(shè)置2個波長進(jìn)行檢測,四氨基嘧啶硫酸鹽、間苯二酚、1,5-萘二酚、2,7-萘二酚、HC黃2號、5-氨基-4-氯鄰甲酚、羥乙基-2-硝基對甲苯胺、N-苯基-對苯二胺、1-萘酚等9種染色劑的檢測波長為280 nm,其余染色劑的檢測波長均為235 nm。樣品盤溫度設(shè)置為5 ℃。

表 2 HPLC梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

在實驗室前期研究[30]中,選用磷酸鹽緩沖體系(0.04 mol/L磷酸二氫鉀和0.01 mol/L磷酸氫二鈉,并含4%乙腈)和乙腈為流動相,通過梯度洗脫實現(xiàn)了33種染發(fā)劑的分離分析,但其中1-羥乙基-4,5-二氨基吡唑硫酸鹽與四氨基嘧啶硫酸鹽、2-氨基-3-羥基吡啶與對苯二胺、4-硝基鄰苯二胺與4-氨基-3-硝基苯酚的分離效果有待提高。因此,本研究分別以上述磷酸鹽緩沖體系-乙腈以及乙酸銨水溶液(含4%乙腈)-乙腈為流動相,比較兩種體系對各種染發(fā)劑的分離效果。結(jié)果表明,乙酸銨體系(見圖1a)對10 min內(nèi)出峰染發(fā)劑的洗脫效果明顯優(yōu)于磷酸鹽體系(見圖1b),可有效解決極性較大染發(fā)劑的分離問題;兩個體系(見圖1c和1d)對10 min后出峰染發(fā)劑的洗脫效果相當(dāng)。綜上,選用乙酸銨體系作為流動相。在此基礎(chǔ)上,比較不同濃度(0.01、0.02和0.03 mol/L)乙酸銨水溶液的分離效果,發(fā)現(xiàn)0.02 mol/L及0.03 mol/L乙酸銨水溶液的分離效果相當(dāng),均優(yōu)于0.01 mol/L乙酸銨水溶液。從節(jié)約試劑及保護(hù)色譜柱的角度考慮,最終選擇0.02 mol/L乙酸銨水溶液(含4%乙腈)和乙腈作為流動相。

圖 1 采用不同流動相時染發(fā)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of dyes in the mixed standard solution using different mobile phases Mobile phases: for (a) and (c), (A) 0.02 mol/L ammonium acetate aqueous solution (containing 4% ACN) and (B) ACN; for (b) and (d), (A) 0.04 mol/L potassium dihydrogen phosphate and 0.01 mol/L disodium hydrogen phosphate (containing 4% ACN) and (B) ACN. Gradient elution procedure: 0-25 min, 0%B； 25-42 min, 0%B-14%B； 42-46 min, 14%B-40%B； 46-56 min, 40%B-60%B； 56-58 min, 60%B-0%B; 58-63 min, 0%B. Column temperature: 35 ℃; detection wavelength: 235 nm.

2.2 色譜柱及柱溫的選擇

繼續(xù)使用前期研究[30]選定的Waters Atlantis?T3 MV Kit色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)進(jìn)行分離,并比較25、30和35 ℃柱溫下的分離效果。結(jié)果表明,適當(dāng)升溫有助于色譜峰峰形的改善,可一定程度提高各染發(fā)劑的分離度。故進(jìn)一步對30 ℃與35 ℃柱溫條件進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)30 ℃柱溫更利于25 min前出峰的染發(fā)劑的分離,而35 ℃更利于30 min后出峰的染發(fā)劑的分離。綜上,考慮采用梯度變溫的方式,25 min前柱溫為30 ℃, 30 min后為35 ℃, 25～30 min色譜峰少,在此段時間內(nèi)完成升溫比較合適,故將此段時間作為變溫過渡期。另外,為保證多次進(jìn)樣之間的重復(fù)性,在60 min后將溫度降回初始溫度30 ℃,并維持6 min,以實現(xiàn)系統(tǒng)平衡。經(jīng)過多種嘗試,最終確定1.4節(jié)描述的變溫程序,確保絕大多數(shù)染發(fā)劑分離良好,且未見保留時間漂移。

2.3 檢測波長的選擇

采用DAD檢測器在210～400 nm范圍對40種染發(fā)劑進(jìn)行全波長掃描,發(fā)現(xiàn)多數(shù)染發(fā)劑的最大吸收波長為220～245 nm,而235 nm下各染發(fā)劑均有較強的紫外吸收,認(rèn)為該波長可以兼顧各成分的檢測,因此首選235 nm為檢測波長。但有9種染發(fā)劑存在特殊情況,具體如下:四氨基嘧啶硫酸鹽、間苯二酚及N-苯基-對苯二胺在280 nm下吸收強于235 nm; 60 min后出峰的HC黃2號、5-氨基-4-氯鄰甲酚、羥乙基-2-硝基對甲苯胺、N-苯基-對苯二胺及1-萘酚在235 nm下受到雜質(zhì)峰干擾較嚴(yán)重;235 nm下,1,5-萘二酚、2,7-萘二酚及1-萘酚高濃度點響應(yīng)過載。以上9種染發(fā)劑除了在低波長有最大吸收外,在275～310 nm有特征吸收,而280 nm可保證各成分的紫外吸收均較強,因此選擇280 nm作為這9種染發(fā)劑的檢測波長。利用1.4節(jié)色譜條件進(jìn)行檢測,得到40種染發(fā)劑在兩種波長下的色譜圖見圖2。

圖 2 40種染發(fā)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在兩種波長下的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the 40 dyes in mixed standard solution at two wavelengthsPeak Nos. were the same as that in Table 1.

2.4 方法適用性

在確定流動相與色譜柱種類后,對梯度洗脫條件進(jìn)行摸索與優(yōu)化,最終確定1.4節(jié)下的色譜條件,利用此條件進(jìn)行分析,40種染發(fā)劑可實現(xiàn)有效分離(見圖2)。

同時發(fā)現(xiàn),采用本文方法檢測準(zhǔn)用染發(fā)劑對甲基氨基苯酚硫酸鹽時,其與N,N-雙(2-羥乙基)-對苯二胺硫酸鹽保留時間非常接近。實際檢驗過程中,若樣品只含這2種染發(fā)劑中的1種,則可通過紫外光譜確定染發(fā)劑種類(見圖3);若樣品中同時含有上述2種染發(fā)劑,則可參考實驗室前期建立的33種染發(fā)劑的測定方法[30],即采用25 ℃柱溫,以磷酸鹽緩沖液(0.04 mol/L磷酸二氫鉀和0.01 mol/L磷酸氫二鈉)-乙腈(96∶4, v/v)作為流動相進(jìn)行等度洗脫,該方法可實現(xiàn)2種染發(fā)劑的有效分離與準(zhǔn)確定量。

圖 3 2種染發(fā)劑的紫外吸收光譜圖Fig. 3 Ultraviolet absorption spectra of the two dyes a. p-methylaminophenol sulfate; b. N,N-bis(2-hydroxyethyl)-p-phenylenediamine sulfate.

在國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上查詢2016～2018年注冊的1 000余種染發(fā)產(chǎn)品批件的配方信息。統(tǒng)計表明,3年注冊的國產(chǎn)染發(fā)類產(chǎn)品中,未見對甲基氨基苯酚硫酸鹽與N,N-雙(2-羥乙基)-對苯二胺硫酸鹽同時添加使用的情況;而僅7種進(jìn)口產(chǎn)品同時添加了上述2種染發(fā)劑。可見,這2種染發(fā)劑同時添加使用的概率較低,故認(rèn)為本方法適用于絕大多數(shù)氧化型染發(fā)產(chǎn)品中染發(fā)劑的測定。

2.5 提取溶劑的選擇

依照《規(guī)范》[25]提供的樣品前處理方法,取樣品0.5 g,加入2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-無水乙醇(1∶1, v/v)至10 mL,超聲提取15 min后對所得樣品溶液進(jìn)行色譜分析,發(fā)現(xiàn)對苯二胺、2-氨基-3-羥基吡啶、羥乙基對苯二胺等極性較大的染發(fā)劑出現(xiàn)“溶劑效應(yīng)”,即色譜峰“分叉”。而用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液將上述樣品溶液稀釋至25 mL后,可有效解決此問題。因此,將樣品前處理方法改為取樣0.5 g,加入2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液和無水乙醇混合溶液至10 mL,超聲提取后再加2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液至25 mL。

進(jìn)一步比較含10%、30%、50%、70%及90%體積分?jǐn)?shù)乙醇的亞硫酸氫鈉水溶液對四氨基嘧啶硫酸鹽、2-氨基-3-羥基吡啶、對苯二胺、甲苯-2,5-二胺硫酸鹽、間氨基苯酚、間苯二酚、2-甲基間苯二酚、4-氨基-2-羥基甲苯、4-氨基-3-硝基苯酚、2,6-二羥乙基氨甲苯、4-氯間苯二酚、1-萘酚等12個使用頻率較高且極性差異大的染發(fā)劑的提取效果。經(jīng)對比,認(rèn)為染發(fā)劑整體提取效果隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而提升。但發(fā)現(xiàn),采用含90%乙醇的亞硫酸氫鈉水溶液制備樣品溶液時,即使加入亞硫酸氫鈉水溶液稀釋,對苯二胺等成分仍存在溶劑效應(yīng),色譜峰峰形不佳;采用含70%乙醇的亞硫酸氫鈉水溶液提取時,整體效果僅次于90%組。綜上,選定含70%乙醇的亞硫酸氫鈉水溶液作為提取溶劑,并確定1.3節(jié)的樣品前處理方法。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

在1.4節(jié)色譜條件下分析標(biāo)準(zhǔn)溶液,以染發(fā)劑的質(zhì)量濃度(C, mg/L)為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表3。40種染發(fā)劑在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999 8。

稱取0.5 g(精確至0.001 g)空白基質(zhì)樣品(配方中不含本研究測定的40種染發(fā)劑),分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理,分別以信噪比S/N為3和10時對應(yīng)的含量作為檢出限(LOD)與定量限(LOQ), 40種染發(fā)劑檢出限為5～168 μg/g,定量限為16～504 μg/g,結(jié)果見表3。

2.6.2加標(biāo)回收率

取基質(zhì)空白樣品,每份0.5 g(精確至0.001 g),分別加入標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.25、2.5和5.0 mL(相當(dāng)于樣品中染發(fā)劑含量分別為2.5、5.0和10 mg/g),每個水平制備平行樣品3份,按1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理,在1.4節(jié)色譜條件下進(jìn)行測定。計算各成分平均回收率及其RSD,結(jié)果見表3。40種染發(fā)劑的平均回收率為81.4%～109.6%, RSD值均小于5%。

2.6.3穩(wěn)定性

取1.2節(jié)制備的100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.4節(jié)色譜條件分別于第0、4、8、12、16、20和24 h進(jìn)行測定,計算各染發(fā)劑峰面積的RSD值。結(jié)果表明,40種染發(fā)劑在24 h內(nèi)峰面積RSD值為0.2%～2.2%,說明穩(wěn)定性良好。

2.7 實際樣品測定

選取12批不同品牌、不同配方且添加染發(fā)劑種類較多的氧化型染發(fā)產(chǎn)品進(jìn)行含量測定。12批樣品中共檢出24種準(zhǔn)用染發(fā)劑,累計檢出數(shù)量為66個,其在產(chǎn)品染發(fā)膏中的檢出含量為0.01%～2.83%,全部符合《規(guī)范》[25]中的染發(fā)劑使用限值規(guī)定。所有樣品均未檢出對甲基氨基苯酚硫酸鹽,1批樣品中檢出N,N-雙(2-羥乙基)-對苯二胺硫酸鹽,此染發(fā)劑具有單一紫外吸收光譜圖譜,無對甲基氨基苯酚硫酸鹽干擾,可利用本方法實現(xiàn)準(zhǔn)確定量。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜法測定氧化型染發(fā)類產(chǎn)品中40種染發(fā)劑,方法操作簡便,準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性良好,利用單一液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析,有效提高了實際應(yīng)用中的檢測效率;研究在《規(guī)范》檢驗方法基礎(chǔ)上增加了13種準(zhǔn)用染發(fā)劑,基本覆蓋了氧化型染發(fā)產(chǎn)品配方中的常用染發(fā)劑。根據(jù)2016～2018年注冊的染發(fā)產(chǎn)品配方統(tǒng)計結(jié)果,以及多個品牌產(chǎn)品的實際測定結(jié)果,認(rèn)為本方法適用于絕大多數(shù)氧化型染發(fā)產(chǎn)品的檢驗檢測。