歐陽(yáng)歡， 熊遂金， 陳健美， 鐘八蓮

(贛南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000)

以柑橘黃龍病為代表的柑橘病害，對(duì)我國(guó)乃至全球柑橘產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響。目前，全球已發(fā)現(xiàn)80余種柑橘病毒類病害，而在我國(guó)已超過15種柑橘病毒及類病毒被報(bào)道[1-2]。胚性愈傷組織是利用柑橘珠心胚脫毒及原生質(zhì)體融合等生物技術(shù)育種的重要材料。柑橘珠心胚主要由珠心胚原基細(xì)胞發(fā)育而成，它們起源于珠心組織珠孔端的一兩層細(xì)胞內(nèi)，在珠孔到珠心的中間、胚囊邊緣第1層及鄰近珠被的珠心外表皮甚至合點(diǎn)端有時(shí)也偶爾存在珠心胚原基細(xì)胞，珠心胚原基細(xì)胞的細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)濃厚，明顯區(qū)別于其他細(xì)胞，并形成厚細(xì)胞壁將其與周圍珠心組織隔離開來(lái)[3]。病毒通常是經(jīng)過維管束的韌皮部傳播的，而珠心與維管系統(tǒng)無(wú)直接聯(lián)系，由珠心細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)生的植株可以免除病毒的危害[4]。但珠心胚大多是不育的，必須分離培養(yǎng)才能發(fā)育成正常的幼苗。Navarro等[5]用組織培養(yǎng)的方法，從單胚性的克里曼丁橘上培養(yǎng)出了無(wú)病毒的良種珠心苗。高峰等[6]對(duì)華盛頓臍橙的未受精胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)獲得了脫去裂皮病和衰退病的無(wú)病毒珠心苗。對(duì)于具有多胚性的柑橘品種來(lái)說，珠心胚可取自種子中的非合子胚，但是對(duì)于單胚性或無(wú)籽的柑橘品種，珠心胚只能通過未受精胚珠進(jìn)行離體組織培養(yǎng)來(lái)獲得。本研究是在組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，以贛南早臍橙、紐荷爾臍橙、哈姆林甜橙不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的未受精胚珠為外植體，通過比較不同取樣時(shí)間及誘導(dǎo)培養(yǎng)基下的未受精胚珠愈傷誘導(dǎo)率和胚性愈傷誘導(dǎo)率，以期建立一個(gè)高效的甜橙胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

贛南早臍橙、紐荷爾臍橙、哈姆林甜橙取自國(guó)家臍橙工程技術(shù)研究中心柑橘種質(zhì)資源圃。從2019年6月9日起至8月27日，每隔10 d取1次贛南早臍橙、紐荷爾臍橙和哈姆林甜橙的果實(shí)，共取樣9次。3個(gè)品種的花期在4月初左右，第1次采樣的時(shí)間記為花后65 d，之后取樣時(shí)間以此推算。

1.2 方法

將取回的柑橘果實(shí)用自來(lái)水清洗干凈表皮后，在超凈臺(tái)用75%乙醇表面消毒，無(wú)菌水清洗，將果實(shí)剖開，去掉果肉，可發(fā)現(xiàn)囊衣內(nèi)緊靠中柱處有許多未發(fā)育的小胚珠，長(zhǎng)1～2.5 mm。用小鑷子將這些小胚珠輕輕挑下，放入預(yù)先配置好的5種培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)材料30 d繼代1次，60 d后記錄數(shù)據(jù)?；A(chǔ)培養(yǎng)基是MT+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂，在此基礎(chǔ)上添加不同激素，配置成5種不同培養(yǎng)基(表1)。

表1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配方

1.3 數(shù)據(jù)處理

出愈率=形成愈傷組織個(gè)數(shù)/外植體接種總數(shù)×100%。

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=形成胚性愈傷組織個(gè)數(shù)/外植體接種總數(shù)×100%。

數(shù)據(jù)整理及分析采用Microsoft Excel 2007軟件，作圖采用SigmaPlot 13軟件。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)獲得的甜橙愈傷組織分為胚性細(xì)胞和非胚性細(xì)胞2種，二者在細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)上有很大區(qū)別。柑橘的胚性和非胚性愈傷組織的外觀形態(tài)差異如圖1所示。柑橘的胚性愈傷組織是白色或乳白色的疏松的愈傷組織顆?；蛴鷤麍F(tuán)，能夠較快地增殖并能長(zhǎng)期繼代保存；非胚性愈傷組織是米黃色的致密愈傷組織塊，幾乎不增殖，易于再生芽。非胚性愈傷組織不能繼代保存，而胚性愈傷組織能夠較快的增殖并能長(zhǎng)期繼代保存。

A—?jiǎng)偨臃N未受精胚珠；B—誘導(dǎo)60 d獲得的非胚性愈傷組織；C—誘導(dǎo)60 d獲得的胚性愈傷組織；D—胚性愈傷組織經(jīng)分化培養(yǎng)30 d后的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2.1 贛南早臍橙誘導(dǎo)培養(yǎng)基及采樣時(shí)間的篩選

5種培養(yǎng)基對(duì)贛南早臍橙未成熟胚珠誘導(dǎo)成愈傷組織均有效，尤其是培養(yǎng)基E，其愈傷誘導(dǎo)率在88.74%～100%，誘導(dǎo)效果顯著。但是，培養(yǎng)基E對(duì)贛南早臍橙胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效果不佳，最高只有12.78%，即培養(yǎng)基E誘導(dǎo)的愈傷基本為非胚性愈傷組織。培養(yǎng)基A對(duì)贛南早臍橙未成熟胚珠的愈傷在115 d達(dá)到最好效果，為97.02%；其次在125 d為96.11%，最低出愈率是61.90%，但整個(gè)采樣時(shí)間胚性愈傷率都非常低，除了在早期65 d和75 d時(shí)有少量胚性愈傷被誘導(dǎo)，出愈率分別為7.41%和2.09%，其余時(shí)間取樣的胚性愈傷誘導(dǎo)率為0。培養(yǎng)基B誘導(dǎo)的胚性愈傷誘導(dǎo)率最高只有10.00%，即贛南早臍橙未成熟胚珠經(jīng)培養(yǎng)基B誘導(dǎo)的愈傷大部分為非胚性愈傷，只有少部分為胚性愈傷組織。贛南早臍橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基C誘導(dǎo)后，其出愈率在75 d達(dá)到最大值，并在105 d開始下降，降至145 d的66.67%，同時(shí)培養(yǎng)基C誘導(dǎo)后的胚性愈傷率在整個(gè)采樣時(shí)期呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，在95 d達(dá)到峰值為23.64%。而經(jīng)培養(yǎng)基D誘導(dǎo)后，贛南早臍橙未受精胚珠愈傷誘導(dǎo)率在85 d達(dá)到最高值為97.77%，從95 d開始下降，而胚性愈傷率在105 d達(dá)到最高值為35.90%(圖2)。綜上，培養(yǎng)基A和E對(duì)贛南早臍橙未受精胚珠愈傷誘導(dǎo)較好，但是胚性愈傷效果不顯著，要得到較多的贛南早臍橙胚性愈傷組織則應(yīng)使用培養(yǎng)基D，在105 d進(jìn)行采樣。

圖2 贛南早臍橙在5種不同培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)組織情況

2.2 紐荷爾臍橙誘導(dǎo)培養(yǎng)基及采樣時(shí)間的篩選

紐荷爾臍橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基A誘導(dǎo)的出愈率在105 d達(dá)到最大值81.98%，最小值為125 d的36.35%，但是其胚性愈傷率最高僅有1.85%，說明培養(yǎng)基A對(duì)于胚性愈傷的誘導(dǎo)效果不顯著。培養(yǎng)基B的出愈率在95 d之前保持在95.29%，從105 d開始下降，最低到達(dá)135 d的69.68%，同時(shí)經(jīng)培養(yǎng)基B誘導(dǎo)后的胚性愈傷率也在95 d達(dá)到最高值，為19.81%，且從105 d后開始下降，最低降至135 d的0.95%。紐荷爾臍橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基C誘導(dǎo)后的出愈率在75 d和85 d達(dá)到最高值，均為100%，從105 d開始下降，在125 d達(dá)到最低值為70.00%；其胚性愈傷誘導(dǎo)率在95 d達(dá)到最大值56.21%，之后開始下降，即紐荷爾臍橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基C誘導(dǎo)后，采樣時(shí)間為95 d的愈傷誘導(dǎo)率較高且胚性愈傷誘導(dǎo)率也最高。培養(yǎng)基D的愈傷誘導(dǎo)率在105 d以前保持在90.00%以上，105 d以后略有下降；而培養(yǎng)基D誘導(dǎo)的胚性愈傷率在95 d達(dá)到最高值32.51%，在75～95 d期間呈上升趨勢(shì)，95～145 d期間呈下降趨勢(shì)。培養(yǎng)基E對(duì)紐荷爾臍橙未受精胚珠的胚性愈傷誘導(dǎo)在整個(gè)采樣時(shí)期效果均不佳，但出愈率保持在92.57%以上(圖3)。綜上，紐荷爾臍橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基A、E誘導(dǎo)后得到的愈傷基本為非胚性愈傷組織，且培養(yǎng)基E的誘導(dǎo)效果要優(yōu)于培養(yǎng)基A，而培養(yǎng)基B、C、D誘導(dǎo)的胚性出愈率在95 d采樣時(shí)間達(dá)到最大值，其中培養(yǎng)基C的誘導(dǎo)效果最顯著，即紐荷爾臍橙未受精胚珠在95 d采樣使用培養(yǎng)基C誘導(dǎo)效果最佳。

圖3 紐荷爾臍橙在5種不同培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)情況

2.3 哈姆林甜橙誘導(dǎo)培養(yǎng)基及采樣時(shí)間的篩選

哈姆林甜橙未受精胚珠經(jīng)培養(yǎng)基A誘導(dǎo)后的出愈率在85 d達(dá)到最大值73.86%，而胚性愈傷率則僅在125 d達(dá)到最高值5.87%，即培養(yǎng)基A誘導(dǎo)對(duì)胚性愈傷的效果不顯著。經(jīng)培養(yǎng)基B誘導(dǎo)后的出愈率在采樣前期保持在一個(gè)較高的水平，最低只有92.06%，在最后兩次采樣時(shí)開始呈下降趨勢(shì)，但胚性愈傷率在65～95 d呈上升趨勢(shì)，在95 d達(dá)到最高27.78%。培養(yǎng)基C的愈傷誘導(dǎo)效果顯著，胚性愈傷率在65～95 d呈上升趨勢(shì)，且在95 d達(dá)到最高值65.08%，95 d至采樣結(jié)束呈下降趨勢(shì)，在135 d達(dá)到最低值2.86%。對(duì)培養(yǎng)基D來(lái)說，哈姆林甜橙的出愈率在65～105 d呈下降趨勢(shì)，在105 d達(dá)到最低值77.43%，從115 d開始上升至采樣結(jié)束。同時(shí)培養(yǎng)基D對(duì)哈姆林甜橙未受精胚珠不同生長(zhǎng)時(shí)期胚珠胚性愈傷組織的誘導(dǎo)在65～105 d呈上升趨勢(shì)，在105 d達(dá)到最高值，為59.13%，105～145 d呈下降趨勢(shì)。培養(yǎng)基E在75～105 d和125～135 d的誘導(dǎo)效果顯著，這說明這兩個(gè)時(shí)間段培養(yǎng)基E對(duì)哈姆林甜橙未受精胚珠有很好的愈傷誘導(dǎo)效果，但是對(duì)哈姆林甜橙各個(gè)時(shí)期的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效果不佳(圖4)。綜上，培養(yǎng)基A、E用于哈姆林甜橙未受精胚珠愈傷的誘導(dǎo)中，非胚性愈傷誘導(dǎo)效果顯著。培養(yǎng)基B、C、D對(duì)哈姆林甜橙未受精胚珠胚性愈傷組織誘導(dǎo)效果有差異，培養(yǎng)基C、D的誘導(dǎo)效果要優(yōu)于培養(yǎng)基B，若使用培養(yǎng)基C，則最佳采樣時(shí)間為95 d，若使用培養(yǎng)基D，最佳采樣時(shí)間為105 d。

圖4 哈姆林甜橙在5種不同培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)情況

3 小結(jié)與結(jié)論

激素是組培中誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵因子之一，本研究用未加激素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)3個(gè)柑橘品種未受精胚珠的愈傷誘導(dǎo)效率較低，且不能獲得胚性愈傷組織。6-BA對(duì)柑橘胚性愈傷的誘導(dǎo)有顯著效果，培養(yǎng)基B、C、D中，隨著6-BA的濃度逐漸升高，愈傷誘導(dǎo)效率在逐漸升高，但是培養(yǎng)基C、D之間效果相當(dāng)，相差不大。Starrantino等[7]誘導(dǎo)甜橙胚性愈傷組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著細(xì)胞分裂素的增加，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率也隨之提高，認(rèn)為這可能與成熟種子中ABA含量較高有關(guān)，因?yàn)榉N子中高濃度ABA需要赤霉素或高濃度的細(xì)胞分裂素與之相拮抗才能形成胚性愈傷組織。贛南早臍橙為紐荷爾臍橙芽變?cè)缡炱贩N，比目前主栽品種紐荷爾臍橙早熟30 d以上[8]，所以在相同采樣時(shí)期贛南早臍橙比紐荷爾臍橙和哈姆林甜橙成熟度更高，且贛南早臍橙果實(shí)ABA含量出現(xiàn)峰值的時(shí)間早于紐荷爾臍橙，在115 d之前其ABA含量高于紐荷爾臍橙[9]，這可能就解釋了為什么贛南早臍橙胚性愈傷誘導(dǎo)的6-BA最適濃度為7.50 mg·L-1，而紐荷爾臍橙為5 mg·L-1，且在相同的培養(yǎng)基和采樣時(shí)期下哈姆林甜橙的最高胚性愈傷誘導(dǎo)率比贛南早臍橙高的原因。在禾本科植物胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程中，2,4-D是很有效的激素，但是2,4-D誘導(dǎo)下3個(gè)柑橘品種的愈傷為非胚性的致密型愈傷組織，說明2,4-D在柑橘愈傷組織誘導(dǎo)中更利于致密的、非胚性的愈傷組織的形成，且Vardi等[10]認(rèn)為，2,4-D還會(huì)導(dǎo)致愈傷組織染色體的變異。

一般來(lái)說幼嫩的胚珠比老的胚珠較容易誘導(dǎo)胚性愈傷組織，多胚品種比單胚品種誘導(dǎo)更為容易[11]，贛南早臍橙、紐荷爾臍橙、哈姆林甜橙都屬于多胚品種。史文靜等[12]發(fā)現(xiàn)，葡萄的胚珠離體培養(yǎng)時(shí)間在花后5～8周可以得到較好的效果。本研究3個(gè)品種在采樣后期的愈傷誘導(dǎo)效果都不如采樣中期，且最佳胚性愈傷誘導(dǎo)效果都集中在采樣中期。

胚珠是體細(xì)胞再生的理想材料，為難以獲得種子的植物提供育種新思路，王榮梅[13]以未受精胚珠為外植體對(duì)萱草科植物離體雌核進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)效果差異顯著，誘導(dǎo)效果最佳可達(dá)66.67%。劉寶勇[14]在使用朱頂紅的子房進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)獲得了大量由胚珠發(fā)育而成的無(wú)菌苗。本研究通過甜橙未受精胚珠獲得了大量的愈傷組織，為柑橘植株再生提供材料。研究篩選出了贛南早臍橙、紐荷爾臍橙、哈姆林甜橙未成熟胚珠的最佳愈傷誘導(dǎo)方案，其中贛南早臍橙使用培養(yǎng)基MT+7.50 mg·L-16-BA，在105 d進(jìn)行采樣；紐荷爾臍橙使用培養(yǎng)基MT+5.0 mg·L-16-BA且在95 d采樣；哈姆林甜橙使用培養(yǎng)基MT+5.0 mg·L-16-BA在95 d采樣，若使用培養(yǎng)基MT+7.50 mg·L-16-BA，則最佳采樣時(shí)間為105 d。本研究建立了一個(gè)高效的甜橙胚性愈傷誘導(dǎo)體系，為進(jìn)一步研究贛南早臍橙、紐荷爾臍橙、哈姆林甜橙未受精胚珠組織培養(yǎng)、脫毒保存及通過生物技術(shù)手段改良臍橙品種奠定基礎(chǔ)。