賈瑞娟，陳旭峰，胡開(kāi)燕，郭宏萍，許 女*

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801 2 黃土高原特色作物優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 山西太谷030801）

作為中國(guó)“四大名醋”之一的山西老陳醋，其采用傳統(tǒng)自然固體發(fā)酵并結(jié)合獨(dú)特熏、淋、曬等工藝，形成老陳醋獨(dú)特的酸、綿、香、甜風(fēng)味與口感[1]。老陳醋的獨(dú)特風(fēng)味得益于微生物菌群的生長(zhǎng)和代謝以及復(fù)雜的協(xié)同作用，產(chǎn)生豐富的香味物質(zhì)，除霉菌、酵母菌、乳酸菌、醋酸菌外，芽孢菌也是山西老陳醋發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的重要微生物種群，它在老陳醋風(fēng)味和功能成分的形成中起到重要作用[2]。

芽孢桿菌是一類(lèi)數(shù)量眾多的細(xì)菌，需氧或兼性厭氧，桿狀，革蘭氏陽(yáng)性，能夠在某些條件下形成內(nèi)生孢子[3]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于芽孢桿菌的研究已有多年歷史，對(duì)于芽孢桿菌的形態(tài)觀察、分類(lèi)鑒定、生理機(jī)制、功能發(fā)掘以及生物防治等方面的研究已相當(dāng)透徹[4]。2016年，王進(jìn)龍[5]從山西老陳醋中分離出的芽孢菌有：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、萎縮芽孢桿菌（Bacillusatrophaeus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。

芽孢菌在陳醋釀造中起著重要的作用。乙偶姻是山西老陳醋重要功能成分川穹嗪的前體物質(zhì)[6]，而芽孢菌產(chǎn)乙偶姻的能力比乳酸菌、醋酸菌更強(qiáng)、更穩(wěn)定[7]。國(guó)內(nèi)外相關(guān)產(chǎn)乙偶姻菌種的篩選、育種、發(fā)酵工作也大都集中于芽孢菌。2015年，高文睿等[8]從涼州熏醋中篩選出高產(chǎn)乙偶姻的芽孢菌Y4，產(chǎn)量為2.376 mg/mL；2013年，張顯[9]采用傳統(tǒng)誘變方法對(duì)枯草芽孢桿菌JNA 3-10 進(jìn)行復(fù)合誘變，獲得1 株2，3-丁二醇脫氫酶（BDH）缺失型乙偶姻高產(chǎn)突變株JNA-UD-6，消耗150 g/L 葡萄糖，得到53.9 g/L 的乙偶姻和6.5 g/L 的2，3-丁二醇；2017年，Li 等[10]通過(guò)改變2，3-丁二醇的轉(zhuǎn)化策略，提高了地衣芽孢桿菌乙偶姻的產(chǎn)量。芽孢菌在陳醋中除對(duì)產(chǎn)乙偶姻有重要貢獻(xiàn)外，還產(chǎn)生多酚類(lèi)物質(zhì)，從而賦予山西老陳醋抗氧化的功能[11]。2014年，郇阿梅等[12]從四川傳統(tǒng)麩醋醋醅中篩選出1 株芽孢菌YB-32，培養(yǎng)24 h 后產(chǎn)生的總酚含量為263.6 μg/mL。另外，芽孢菌還可產(chǎn)不揮發(fā)性酸，緩解山西老陳醋中乙酸的強(qiáng)烈刺激性酸味，使醋的口感更柔和醇厚[13]。芽孢菌的代謝產(chǎn)物與發(fā)酵體系中的其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成一些風(fēng)味物質(zhì)，如乳酸乙酯、乙酸乙酯、檸檬酸乙酯、二羥基丙酮等，這些物質(zhì)可以很好地改善食醋風(fēng)味[14]。在白酒產(chǎn)業(yè)中，關(guān)于產(chǎn)香芽孢菌的篩選和應(yīng)用積累了大量的研究資料，而在陳醋研究中鮮有關(guān)于產(chǎn)香芽孢菌的篩選和應(yīng)用方面的報(bào)道。

醋酸菌和乳酸菌是山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群。醋酸菌是陳醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中的主要菌種，可以通過(guò)乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶催化反應(yīng)將醇代謝為酸。目前，陳醋釀造中常用的醋酸菌有奧爾蘭醋桿菌（Acetobacter orleanense）、許氏醋桿菌（Acetobacter schuegenbachii）、彎曲醋桿菌（Acetobacter curvum）、紋膜醋桿菌（Acetobacter aceti）、惡臭醋酸桿菌（Acetobacter rancens）、攀膜醋桿菌（Acetobacter ascendans）、膠膜醋桿菌（Acetobacter xylinum）等。醋酸菌在釀醋過(guò)程中除產(chǎn)酸外，還產(chǎn)乙偶姻（川穹嗪前體物質(zhì)）等功能性物質(zhì)。Dai 等[15]報(bào)道了1 株漢氏醋桿菌（acetobacter hansenii）產(chǎn)乙偶姻量達(dá)8.93 g/L。在醋酸發(fā)酵階段中除醋酸菌產(chǎn)酸外，乳酸菌也可產(chǎn)生乳酸等不揮發(fā)性酸，減緩由總酸含量引起的刺激味道，使酸味更柔和、醇厚。此外，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸及其它不揮發(fā)性酸與醇類(lèi)物質(zhì)生成乳酸乙酯等各種酯類(lèi)物質(zhì)，也可豐富山西老陳醋的風(fēng)味和香氣。

微生物之間的互相作用可以增加其代謝物和功能物質(zhì)的含量。關(guān)于芽孢菌間的互作研究主要集中在白酒大曲的強(qiáng)化。2011年，楊濤等[16]將5 株嗜熱芽孢桿菌、3 株酵母菌及1 組復(fù)合產(chǎn)酸菌應(yīng)用于醬香白酒生產(chǎn)中，使得香味基酒的比例增加，并且白酒中的己酸和己酸乙酯含量也顯著提高；2017年，莊孝杰等[17]從醬香型酒醅中篩選出具有優(yōu)良特性的拜耳接合酵母，研究其與地衣芽孢桿菌的互作，結(jié)果表明地衣芽孢桿菌促進(jìn)了拜耳接合酵母的乙醇轉(zhuǎn)化率，共培養(yǎng)體系中風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)和含量也受到很大影響。2015年，吉晉波[18]對(duì)分離自鎮(zhèn)江香醋醋醅的8 株乳酸菌及2 株醋酸菌的相互作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明醋醅中醋酸菌與乳酸菌穩(wěn)定共存，并對(duì)比分析了二者純培養(yǎng)及共培養(yǎng)發(fā)酵液中風(fēng)味化合物的差異。

本文從山西老陳醋釀造過(guò)程中分離的54 株芽孢菌中，篩選出2 株發(fā)酵性狀優(yōu)良的芽孢桿菌菌株，研究了這兩株芽孢菌之間，及與醋酸菌和乳酸菌間的相互作用，考察了其在純培養(yǎng)和不同比例共培養(yǎng)條件下對(duì)生物量、乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸、有機(jī)酸和揮發(fā)性香氣成分的影響，為將來(lái)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)山西老陳醋釀造復(fù)配直投式發(fā)酵劑進(jìn)行了重要的基礎(chǔ)研究和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 醋醅取自醋廠醋酸發(fā)酵0，1，3，5，7，9，11 d 的醋醅。

巴氏醋桿菌33、植物乳桿菌19 為實(shí)驗(yàn)室前期篩選的優(yōu)勢(shì)優(yōu)良菌株，保存至山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與工程學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 MRS 培養(yǎng)基，青島高科園海博生物科技有限公司；模擬醋醅培養(yǎng)基，山西老陳醋醋廠醋酸發(fā)酵第2 天的醋醅，即為模擬醋醅培養(yǎng)基；醋酸菌培養(yǎng)基：酵母10 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，滅菌后加4%無(wú)水乙醇。

細(xì)菌DNA 提取試劑盒，北京博邁德基因科技有限公司；PCR 引物，由深圳華大基因公司合成；Maker D、MIX，上海生工生物工程有限公司；福林試劑、肌酸（均為分析純），北京索萊寶科技有限公司；草酸、丙酮酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 主要儀器、設(shè)備

T100 型PCR 儀、Universial Hood Ⅱ型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad 公司；DYY-6C 型瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一儀器廠；722 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；戴安U3000 液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；Trace1300氣相色譜儀，TraceISQ 質(zhì)譜分析儀；5417R 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山西老陳醋源芽孢菌的分離和鑒定 在無(wú)菌、常溫條件下，將25 g 樣品加入內(nèi)置玻璃珠的225 mL 無(wú)菌生理鹽水中，140 r/min 振蕩培養(yǎng)20 min，使其混勻；然后梯度稀釋?zhuān)x取10-5，10-6，10-73 個(gè)梯度，涂布于MRS 瓊脂平板培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。選取菌落數(shù)在30～300的平板，挑取其上表面粗糙、菌落形態(tài)較大的單個(gè)菌落涂片和革蘭氏染色，在電子顯微鏡（1 000×）下觀察菌株細(xì)胞形態(tài)和拍照。對(duì)鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性、有芽孢的桿狀菌株用試劑盒提取其基因組，16S rDNA 測(cè)序比對(duì)，并用MEGA5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。應(yīng)用的引物如下：上游：5′-CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG -3′ ；下 游 ：5′ -CGACTTCACCCAATCATCTG-3′。將鑒定結(jié)果為芽孢菌的，反復(fù)劃線于MRS 平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，直至獲得純化的菌株，對(duì)其菌落拍照。

1.3.2 山西老陳醋源優(yōu)良芽孢菌的篩選 將54株已鑒定的芽孢菌接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，取菌株發(fā)酵液3 mL，參照文獻(xiàn)[19]、[20]測(cè)定總酯含量及不揮發(fā)性酸含量。將發(fā)酵液8 000 r/min 離心10 min，取上清液1 mL，采用福林-酚比色法測(cè)定多酚含量[21]。取上清液3 mL，采用O'Meara-比色法測(cè)定乙偶姻含量[22]。

1.3.3 解淀粉芽孢桿菌1539 與枯草芽孢桿菌803 的相互作用研究 將篩選出的優(yōu)良芽孢菌株解淀粉芽孢桿菌1539 與枯草芽孢桿菌803 分別接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌體濃度均達(dá)到1×106CFU/mL 時(shí)，分別按照解淀粉芽孢桿菌1539 與枯草芽孢桿菌803 接種比例為1∶0，0∶1，1∶0.1，1∶0.5，1∶1，1∶5，1∶10（V/V）[23]，總接種量為2%，加入30 g 醋醅模擬培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)6 d。

1）生物量的測(cè)定 采用MRS 培養(yǎng)基稀釋平板菌落法測(cè)定解淀粉芽孢桿菌1539 與枯草芽孢桿菌803 的生物量。

2）乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸含量的測(cè)定 取10 g 上述培養(yǎng)6 d 的樣品，加入90 mL 蒸餾水浸泡30 min，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用上述1.3.2 節(jié)方法，測(cè)定純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中芽孢菌的乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸含量。

3）有機(jī)酸含量的測(cè)定 取5 g 上述培養(yǎng)6 d的樣品，用超純水定容50 mL，12 000 r/min 離心5 min，取上清液，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，采用外標(biāo)法測(cè)定草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸及琥珀酸等8 種有機(jī)酸的含量，用HemI 和Simca 軟件繪制有機(jī)酸的Heatmap 圖和PCA 圖。色譜測(cè)定條件為：液相系統(tǒng)UItimate 3000；色譜柱C18 4.6 mm×150 mm，5 μm；流動(dòng)相20 mmol/L NaH2PO4，pH 2.7；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)速度0.8 mL/min；檢測(cè)器UV210 nm；柱溫：室溫。

4）揮發(fā)性香氣種類(lèi)和含量的測(cè)定 采用頂空固相微萃取方法[24]萃取上述培養(yǎng)6 d 的1 g 樣品，用直接內(nèi)標(biāo)法測(cè)定其揮發(fā)性香氣的種類(lèi)和含量，用HemI 和Simca 軟件繪制揮發(fā)性香氣的Heatmap 圖和PCA 圖。色譜條件：色譜柱為VF-5MS（30 mm×0.25×0.25 mm），載氣為氦氣（純度99.999%），流量1 mL/min，不分流。程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min，以4 ℃的速度升至160℃，保持1 min，再以10 ℃/min 的速度升至270 ℃保持5 min。質(zhì)譜條件：接口溫度280 ℃，離子源溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍41～500 amu。

1.3.4 醋酸菌、乳酸菌和芽孢菌共培養(yǎng)的相互作用研究

1）菌體培養(yǎng) 將巴氏醋桿菌33 接種于醋酸菌液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h 后菌體濃度達(dá)1×106CFU/mL，備用。將植物乳桿菌19 接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌體濃度達(dá)1×108CFU/mL，備用。

2）醋酸菌、乳酸菌和芽孢菌的共培養(yǎng) 根據(jù)上述1.3.3 節(jié)方法將解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 按1∶10（V/V）混合，再和巴氏醋桿菌33、植物乳桿菌19 等比例進(jìn)行不同組合的共培養(yǎng)，總接種量為2%，在30 g 醋醅模擬培養(yǎng)基中30 ℃靜置培養(yǎng)6 d。

3）生物量、揮發(fā)性香氣種類(lèi)和含量測(cè)定 用MRS 培養(yǎng)基稀釋平板菌落法測(cè)定植物乳桿菌19、解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 的生物量，醋酸菌培養(yǎng)基稀釋平板菌落法測(cè)定巴氏醋桿菌33 的生物量。采用1.3.3 節(jié)方法，測(cè)定純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中的揮發(fā)性香氣種類(lèi)和含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 山西老陳醋源芽孢菌的分離、鑒定結(jié)果

經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA 測(cè)序比對(duì)，共分離得到54 株芽孢菌。由圖1 可知，54 株芽孢菌中有17 株解淀粉芽孢桿菌，14 株枯草芽孢桿菌，11株地衣芽孢桿菌，1 株莫海威芽孢桿菌，2 株短小芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌、龍舌蘭桿菌和沙福芽孢桿菌，其中解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌均為山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)芽孢菌，分別占芽孢菌的31.36%，26.26%，20.59%。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）可知，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的親源性關(guān)系較近，而與地衣芽孢桿菌的親源性關(guān)系更近，達(dá)99%，另外，短小芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌聚類(lèi)在另一個(gè)分支。典型芽孢菌的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)描述見(jiàn)表1。

表1 山西老陳醋典型芽孢菌菌落和細(xì)胞形態(tài)的描述Table 1 The colony and the cell morphology of typical bacillus isolated from cupei of Shanxi aged vinegar

圖1 山西老陳醋醋醅中分離的芽孢菌種百分含量的餅狀圖Fig.1 Pie chart of the percentage of bacillus species isolated from cupei of Shanxi aged vinegar

圖2 基于16S rDNA 的山西老陳醋典型芽孢菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of typical bacillus isolated from cupei of Shanxi aged vinegar based on the 16S rDNA sequences

圖3 山西老陳醋典型芽孢菌的菌落和細(xì)胞形態(tài)圖Fig.3 The colony and cell morphology of typical bacillus isolated from cupei of Shanxi aged vinegar

2.2 山西老陳醋源優(yōu)良芽孢菌的篩選

從醋醅中分離純化得到54 株芽孢菌菌株，測(cè)定芽孢菌發(fā)酵液的乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸能力。各能力均較高的10 株芽孢菌的乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸含量如圖4所示，其中枯草芽孢桿菌803 產(chǎn)乙偶姻、總酯含量最高，解淀粉芽孢桿菌1539 產(chǎn)多酚、不揮發(fā)酸含量最高。

乙偶姻是山西老陳醋重要功能成分川穹嗪的前體物質(zhì)，為了提高陳醋中川穹嗪含量，一些學(xué)者對(duì)產(chǎn)乙偶姻的菌株進(jìn)行篩選，包括酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和芽孢菌。國(guó)內(nèi)外產(chǎn)乙偶姻菌種的篩選、育種、發(fā)酵也大都集中于芽孢菌?？莶菅挎邨U菌803 產(chǎn)乙偶姻的能力（0.92 mg/mL）遠(yuǎn)高于王霜等[25]從兼香型白酒酒醅中篩選的地衣芽孢桿菌LS9（0.065 mg/mL）和枯草芽孢桿菌S10（0.041 mg/mL）的產(chǎn)乙偶姻能力，而低于高文睿等[26]從涼州熏醋中篩選的芽孢菌Y4（2.376 mg/mL）。芽孢菌不同，產(chǎn)乙偶姻的能力也不同。目前高產(chǎn)乙偶姻的芽孢菌有分離自土壤中的枯草芽孢桿菌JNA3-10和海洋枯草芽孢桿菌DL01[15]。本文篩選高產(chǎn)乙偶姻的芽孢菌為山西老陳醋土著菌，可應(yīng)用于陳醋的生產(chǎn)中，從而提高陳醋中川穹嗪的含量。另外，枯草芽孢桿菌803 產(chǎn)酯的能力也較強(qiáng)（9.67 g/100 mL），對(duì)于醬香型白酒中的產(chǎn)香芽孢菌已有很多報(bào)道，如羅建超等[27]從茅臺(tái)酒高溫大曲中分離篩選出產(chǎn)醬香的枯草芽孢桿菌S1320、解淀粉芽孢桿菌S1011 和地衣芽孢桿菌S1307；吳樹(shù)坤等[28]從沉香型酒醅中分離篩選出4 株產(chǎn)香較好的芽孢桿菌，它們是阿式芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。

由圖4 可知，解淀粉芽孢桿菌1539 產(chǎn)多酚的能力（750.96 μg/mL）高于郇阿梅等[12]從四川麩醋醋醅中分離出的芽孢菌YB-32（263.6 μg/mL）的產(chǎn)多酚能力。山西老陳醋是以高梁為主要原料發(fā)酵的，高粱中富含多酚類(lèi)化合物[29]，因此食醋中含有大量的多酚類(lèi)物質(zhì)。另外，芽孢菌發(fā)酵會(huì)促進(jìn)食醋中多酚含量的提高[30]。山西老陳醋中主要產(chǎn)生的酸為醋酸，不揮發(fā)性酸對(duì)醋味道和風(fēng)味的形成非常重要，能夠緩解刺激的酸味，使食醋口感相對(duì)柔和[31]。除乳酸菌產(chǎn)不揮發(fā)性酸外，芽孢菌也是。本文顯示，解淀粉芽孢桿菌1539 產(chǎn)不揮發(fā)性酸量達(dá)2.93 g/L。

圖4 山西老陳醋醋醅中分離的芽孢菌產(chǎn)乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸量能力Fig.4 The producing ability of acetoin，polyphenols，total esters and non-volatile acid of bacillus isolated from cupei of Shanxi aged vinegar

2.3 解淀粉芽孢桿菌1539 與枯草芽孢桿菌803的相互作用

2.3.1 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中芽孢菌的生物量變化 根據(jù)1.3.4 節(jié)方法，將解淀粉芽孢桿菌1539（產(chǎn)多酚、不揮發(fā)性酸能力最強(qiáng)）和枯草芽孢桿菌803（產(chǎn)乙偶姻、總酯能力最強(qiáng)）按比例共培養(yǎng)，相互作用。由圖5 可知，當(dāng)解淀粉芽孢桿菌1539∶枯草芽孢桿菌803 為1∶0.1（V/V）和1∶0.5（V/V）共培養(yǎng)時(shí)，解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 的生物量與二者1∶1（V/V）時(shí)接近；當(dāng)解淀粉芽孢桿菌1539∶枯草芽孢桿菌803 為1∶10（V/V）共培養(yǎng)時(shí)，解淀粉芽孢桿菌1539 生物量略有提高。以上結(jié)果說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 共培養(yǎng)對(duì)其生物量無(wú)顯著影響。

圖5 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 的生長(zhǎng)曲線Fig.5 The growth curve of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

2.3.2 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中芽孢菌的乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸含量差異 由圖6 可知，以解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 純培養(yǎng)（1∶0 和0∶1）為對(duì)照，研究解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 比例分別為1∶0，0∶1，1∶0.1，1∶0.5，1∶1，1∶5，1∶10（V/V）共培養(yǎng)時(shí)對(duì)乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)酸含量的影響。解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 在純培養(yǎng)（1∶0 和0∶1，V/V）條件下的乙偶姻、總酯含量接近，低于解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 共培養(yǎng)的含量，并且隨著枯草芽孢桿菌803 比例的增加，乙偶姻、總酯含量逐漸增大，當(dāng)解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 按1∶10（V/V）共培養(yǎng)時(shí)乙偶姻、總酯含量最高，分別比純培養(yǎng)提高了96.23%、12.08%。

圖6 解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中的乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸含量Fig.6 The producing ability of acetoin，polyphenol，total ester，non-volatile acid of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803在純培養(yǎng)（1∶0 和0∶1，V/V）條件下的多酚含量明顯低于解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 共培養(yǎng)的含量，當(dāng)解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 按體積比為1∶5 和1∶10 共培養(yǎng)時(shí)多酚含量較高，分別為179.82 μg/mL 和197.52 μg/mL。解淀粉芽孢桿菌1539、枯草芽孢桿菌803在純培養(yǎng)（1∶0 和0∶1，V/V）條件下的不揮發(fā)酸含量與解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803按1∶0.1，1∶0.5，1∶1（V/V）共培養(yǎng)時(shí)的含量接近，當(dāng)解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 按體積比為1∶5 和1∶10 共培養(yǎng)時(shí)不揮發(fā)酸的含量較高，分別為6.28 g/L 和8.26 g/L。

微生物的互作是一個(gè)精密而復(fù)雜的體系，機(jī)制復(fù)雜，菌體細(xì)胞間通過(guò)生理接觸，產(chǎn)生信號(hào)分子及誘導(dǎo)環(huán)境變化，從而引起微生物形態(tài)和代謝產(chǎn)物的變化。解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 在共培養(yǎng)下，乙偶姻、多酚、總酯、不揮發(fā)性酸的含量發(fā)生變化，而且均比純培養(yǎng)時(shí)有所提高。孟醒[32]在醬香型白酒釀造來(lái)源的釀酒酵母與地衣芽孢桿菌相互作用特征及機(jī)制的初步解析中，比較單菌與混菌發(fā)酵體系中釀酒酵母的生理代謝特征及其與地衣芽孢桿菌的相互作用，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母和地衣芽孢桿菌1∶100 混合體系能夠產(chǎn)生更多的酯類(lèi)風(fēng)味化合物。

2.3.3 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中芽孢菌有機(jī)酸含量的差異 有機(jī)酸是山西老陳醋總酸中的重要成分，可以緩和陳醋的刺激性，使酸味柔和。以解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 純培養(yǎng)為對(duì)照，研究共培養(yǎng)相互作用對(duì)芽孢菌有機(jī)酸含量的影響。由圖7、圖8 可知，解淀粉芽孢桿菌1539和枯草芽孢桿菌803 在純培養(yǎng)（1∶0 和0∶1，V/V）時(shí)，二者的有機(jī)酸譜相似，檸檬酸和琥珀酸含量最高；在共培養(yǎng)時(shí)，二者比例為1∶0.1，1∶0.5，1∶1（V/V）的有機(jī)酸譜相似。解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 為1∶0.5（V/V）共培養(yǎng)時(shí)的蘋(píng)果酸含量最高；二者比例為1∶10（V/V）共培養(yǎng)時(shí)，草酸、丙酮酸、酒石酸、乳酸的含量都顯著升高，分別比純培養(yǎng)（1∶0，V/V）時(shí)提高89.78%，88.32%，22.92%，32.98%，它們可以緩沖乙酸帶來(lái)的刺激酸味，使醋的口感變得柔和，其中丙酮酸具有愉快的香味和帶有微辣的甜味，可豐富陳醋的口感；乳酸與醇類(lèi)物質(zhì)酯化生成脂類(lèi)物質(zhì)，如乳酸乙酯，可以很好地改善陳醋的風(fēng)味。

圖7 解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中有機(jī)酸含量熱圖Fig.7 Heat map of organic acid content of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

圖8 解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中有機(jī)酸的PCA 分析Fig.8 PCA analysis of organic acid of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

2.3.4 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中芽孢菌揮發(fā)性香氣成分的差異 風(fēng)味物質(zhì)的種類(lèi)及含量不僅決定山西老陳醋獨(dú)特的口感及滋味，而且與產(chǎn)品質(zhì)量密切相關(guān)。芽孢菌是多種風(fēng)味物質(zhì)的生產(chǎn)菌株，目前已有從酒醅中篩選的地衣芽孢桿菌與拜耳接合酵母菌的相互作用研究，豐富了體系風(fēng)味研究。由圖9 可知，解淀粉芽孢桿菌1539∶枯草芽孢桿菌803共培養(yǎng)1∶10（V/V）時(shí)，山西老陳醋揮發(fā)性香氣成分含量和種類(lèi)最豐富，其特征風(fēng)味物質(zhì)乙酸乙酯、乙酸丁酯、異戊酸乙酯、甲酸異丁酯、異丁酸乙酯等酯類(lèi)以及異戊醇、正己醇、仲丁醇等醇類(lèi)和4-壬酮、2-庚酮的含量均顯著提高，分別提高85.23%，62.31%，72.16%，46.21%，48.56%，75.56%，32.16%，31.68%，68.49%，51.34%。由圖10 可知，在純培養(yǎng)（1∶0 和0∶1，V/V）時(shí)，解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 均位于PC1、PC2 的負(fù)方向，揮發(fā)性香氣種類(lèi)較少且譜圖相似；在共培養(yǎng)時(shí)，解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803比例為1∶0.1，1∶0.5，1∶5（V/V）時(shí)均位于PC1、PC2的正方向，產(chǎn)揮發(fā)性香氣成分的種類(lèi)及含量相近；解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803比例為1∶10（V/V）時(shí)，位于PC1 的正方向，PC2的負(fù)方向，而風(fēng)味物質(zhì)多集中于PC1 的正方向，說(shuō)明二者共培養(yǎng)1∶10 時(shí)，風(fēng)味物質(zhì)種類(lèi)最豐富。

圖9 解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中各風(fēng)味物質(zhì)含量Fig.9 Heat map of volatile aroma components of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

圖10 解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中風(fēng)味的PCA 分析Fig.10 PCA analysis of the volatile aroma components of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

具有果香味的乙酸乙酯、乙酸丁酯，具有香蕉香氣和酸甜氣味的異戊酸乙酯，具有朗姆酒甜香味的異丁酸乙酯，具有蘋(píng)果白蘭地香氣和辛辣味的異戊醇，具有淡青嫩枝葉氣息的正己醇等風(fēng)味共同協(xié)調(diào)，構(gòu)成山西老陳醋的獨(dú)特風(fēng)味，使其不刺激，香不掩體奪主，酸香，醇厚，略帶甜味的風(fēng)格更加生動(dòng)。另外，在解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 共培養(yǎng)1∶10（V/V）時(shí)，椰子醛、苯乙醛、癸醛、糠醛、壬醛等醛類(lèi)物質(zhì)含量顯著降低，微量的醛類(lèi)所形成的辣味，對(duì)陳醋的五味調(diào)和起到一定的作用，而醛類(lèi)含量過(guò)多，會(huì)有較重的辛辣味，刺激性較大[31]。綜上可知，與純培養(yǎng)時(shí)相比，解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 的混合培養(yǎng)體系中部分揮發(fā)性香氣成分的含量及種類(lèi)增多，這些香氣成分是山西老陳醋中的主要特征風(fēng)味物質(zhì)，其含量變化對(duì)山西老陳醋品質(zhì)有重要影響。

2.4 醋酸菌、乳酸菌和芽孢菌的相互作用

2.4.1 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中醋酸菌、乳酸菌和芽孢菌的生物量變化 醋酸菌、乳酸菌是山西老陳醋醋酸發(fā)酵過(guò)程的主要菌種。在此過(guò)程中，芽孢菌作為協(xié)調(diào)菌，在山西老陳醋中產(chǎn)生豐富的香味物質(zhì)。高通量測(cè)序結(jié)果表明：巴氏醋桿菌和植物乳桿菌是山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)菌株。根據(jù)1.3.5 節(jié)方法對(duì)巴氏醋桿菌33、植物乳桿菌19以及分離自醋醅的解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 進(jìn)行互作研究。由圖11 可知，當(dāng)巴氏醋桿菌33、植物乳桿菌19 以及解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 共培養(yǎng)時(shí)，它們的生物量均低于純培養(yǎng)的生物量。從山西老陳醋醋醅中分離篩選到的2 株優(yōu)勢(shì)芽孢菌解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803，對(duì)巴氏醋桿菌33、植物乳桿菌19 的生長(zhǎng)均無(wú)抑制作用。劉敏[33]篩選產(chǎn)酸芽孢菌，將其與乳酸菌混合發(fā)酵，結(jié)果表明枯草芽孢桿菌23-1 對(duì)保加利亞乳桿菌L1 的生長(zhǎng)影響雖不顯著，但可以刺激保加利亞乳桿菌的產(chǎn)酸能力，其互作機(jī)理還有待研究。

圖11 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中醋酸菌、乳酸菌與芽孢菌的生長(zhǎng)曲線Fig.11 The growth curve of acetic acid bacteria，lactic acid bacteria and bacillus in pure and co-culture

2.4.2 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中揮發(fā)性香氣成分的差異 含有醇類(lèi)、醛類(lèi)、酸類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)等各種物質(zhì)，對(duì)山西老陳醋香味物質(zhì)的呈現(xiàn)有重要影響，這些物質(zhì)的種類(lèi)、含量及比例變化與食醋香氣類(lèi)型的構(gòu)成有著非常密切的關(guān)系。以香味物質(zhì)為主要參考指標(biāo)進(jìn)行陳醋發(fā)酵菌種的選擇具有重要的作用，因此，研究芽孢菌、醋酸菌和乳酸菌純培養(yǎng)與共培養(yǎng)的揮發(fā)性香氣成分具有重要意義。由圖12 可知，從風(fēng)味物質(zhì)的組成和含量變化來(lái)看，巴氏醋桿菌33 和植物乳桿菌19 共培養(yǎng)有利于山西老陳醋中貢獻(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)的形成，其中具有花香、甜香的苯甲醇，水果香的乙酸乙酯，甜蜜香味的乙酸苯乙酯，巧克力和奶油風(fēng)味的2，5-二甲基吡嗪等對(duì)山西老陳醋風(fēng)味有貢獻(xiàn)，分別提高了42.16%，64.23%，56.89%，31.26%。當(dāng)巴氏醋桿菌33、植物乳桿菌19 以及解淀粉芽孢桿菌1539和枯草芽孢桿菌803 培養(yǎng)時(shí)，揮發(fā)性香氣成分含量和種類(lèi)最豐富，其中，乙酸乙酯、異戊酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸異丁酯、壬酸乙酯、乙酸、2-甲基己酸、3-氨基丁酸、1-壬醇、1-辛烯-3-醇、2-甲基丁醇、3-壬醇、苯乙醇、庚醇、椰子醛、癸醛、2-庚酮的含量均顯著提高。

圖12 醋酸菌、乳酸菌與芽孢菌純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中各風(fēng)味物質(zhì)含量Fig.12 Heat map of volatile aroma components of acetic acid bacteria，lactic acid bacteria and bacillus in pure and co-culture

由圖13 可知，當(dāng)巴氏醋桿菌33、植物乳桿菌19 以及解淀粉芽孢桿菌1539 和枯草芽孢桿菌803 共培養(yǎng)時(shí)位于PC1 的負(fù)方向，PC2 的正方向，而風(fēng)味物質(zhì)多集中于PC1 的負(fù)方向，說(shuō)明共培養(yǎng)時(shí)風(fēng)味物質(zhì)豐度最高。而具有水果香味的乙酸乙酯，香蕉香氣和酸甜氣味的異戊酸乙酯，蘑菇香、水果香的1-辛烯-3-醇，甜橙油和檸檬油香氣的癸醛是山西老陳醋的特征香氣物質(zhì)，可以豐富山西老陳醋的口感，分別比純培養(yǎng)時(shí)提高了78.65%，49.26%，42.17%，52.69%。上述結(jié)果說(shuō)明醋酸菌、乳酸菌、芽孢菌協(xié)同發(fā)酵有利于山西老陳醋風(fēng)味的形成，應(yīng)進(jìn)一步研究混合菌相互機(jī)理。

圖13 醋酸菌、乳酸菌與芽孢菌純培養(yǎng)和共培養(yǎng)體系中風(fēng)味的PCA 分析Fig.13 PCA analysis of the volatile aroma components of acetic acid bacteria，lactic acid bacteria and bacillus in in pure and co-culture

3 結(jié)論

從山西老陳醋釀造過(guò)程中分離出的54 株芽孢菌中，篩選1 株產(chǎn)多酚和產(chǎn)不揮發(fā)性酸能力強(qiáng)的解淀粉芽孢桿菌1539 以及1 株產(chǎn)乙偶姻和產(chǎn)酯能力強(qiáng)的枯草芽孢桿菌803，通過(guò)組合發(fā)酵研究二者共培養(yǎng)時(shí)的代謝變化，結(jié)果表明：以1∶10（V/V）的比例共培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵液中乙偶姻、多酚、總酯及不揮發(fā)性酸含量均顯著提高，典型揮發(fā)性香氣物質(zhì)的種類(lèi)和含量也顯著提高。將其芽孢菌和巴氏醋桿菌33、植物乳桿菌19 共培養(yǎng)發(fā)酵研究其代謝變化，結(jié)果三者等比例共培養(yǎng)時(shí)豐富了揮發(fā)性香氣譜圖，并且山西老陳醋的特征風(fēng)味物質(zhì)含量也顯著提高，證明了芽孢菌具有作為山西老陳醋強(qiáng)化直投式發(fā)酵劑的巨大潛力。