鄒堅橋，高觀禎，楊多佳，汪惠勤，柯李晶*，彭彰文，周建武，饒平凡，金義光，余兆碩，羅思浩

（1 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院-浙江工商大學(xué)食品營養(yǎng)科學(xué)聯(lián)合研究中心 杭州310035 2 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京100850）

毛細管電泳是以毛細管為分離場所，在高壓電場的驅(qū)動力下，帶電粒子依據(jù)淌度和分配系數(shù)不同而實現(xiàn)快速分離的電泳技術(shù)，具有高效、簡便、檢出限低、靈敏度高等優(yōu)勢。近年來，毛細管電泳廣泛應(yīng)用于基質(zhì)復(fù)雜的食品檢測分析，例如Li等[1]采用毛細管區(qū)帶電泳檢測食品中的納他霉素含量；田春秋等[2]利用毛細管電泳檢測牛奶中的青霉素中間體以及3 種青霉素類藥物；劉鳴暢等[3]將毛細管電泳用于檢測摻假燕窩中銀耳成分。基于不同細胞和不同生理活性條件下細胞表面帶電性的差異，毛細管電泳是細胞分離分析的有效手段。例如Lu 等[4]利用毛細管電泳鑒別不同動物的紅細胞；溫桂蘭等[5]采用毛細管電泳研究釀酒酵母凋亡細胞。

巨噬細胞是機體內(nèi)重要的免疫細胞，具有識別、吞噬和清除凋亡細胞及非功能性的胞外成分等功能，其在不同環(huán)境和生理條件下有著明顯的形態(tài)和功能差異[7-9]，常作為評估食品組分對人體作用的試驗細胞模型。程安瑋等[10]發(fā)現(xiàn)甘草多糖能激活巨噬細胞，提高其吞噬能力和能量代謝水平，同時可分泌多種具有殺瘤作用的活性因子；Wang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)豬骨湯中納米膠粒與巨噬細胞作用后，被迅速內(nèi)化，防止活性氧自由基引起的線粒體功能障礙和吞噬抑制；杜華英等[12]認為河蜆糖蛋白通過影響巨噬細胞吞噬能力來發(fā)揮免疫活性。李杰萍等[6]利用毛細管電泳定量分析巨噬細胞中5-脂氧合酶信使核糖核酸表達。然而，目前尚未見用毛細管電泳分離巨噬細胞的研究。

河蜆湯具有良好的保肝護肝功效，在煮湯過程中產(chǎn)生大量的自組裝活性納米膠粒[13-15]，納米膠粒被攝食進入消化道后，首先與包括巨噬細胞在內(nèi)的黏膜細胞發(fā)生相互作用，其效應(yīng)不明。作者先期研究已建立河蜆湯納米膠粒的毛細管區(qū)帶電泳分離分析方法[16]。本文以河蜆湯為例，嘗試利用毛細管區(qū)帶電泳，觀測河蜆湯與巨噬細胞作用后湯的多尺度組分與納米膠粒的變化，以及巨噬細胞相應(yīng)的表觀形貌、表面電荷和功能的變化，以期建立一種簡便、快速的研究食品成分-人體相互作用的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將河蜆（臺灣花蓮立川漁場饋贈）與水按物料比1∶1 煮沸60 min，冷卻后紗布過濾，濾過液即為粗制的河蜆湯。

胎牛血清（FBS），購于以色列Biological Industries 公司；0.25%胰酶消化液、青霉素-鏈霉素混合溶液、DMEM 培養(yǎng)基、D-Hank's 細胞平衡液等細胞培養(yǎng)試劑，購于杭州蒂恩延源科技有限公司；甲醇（色譜純）、硼酸、硼砂、二水合磷酸氫二鈉、十二水合磷酸二氫鈉、葡萄糖等試劑，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；試驗用試劑除特別說明外均為分析純，水為超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）。

SD 大鼠（SPF 級，180～200 g）由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。

1.2 儀器與設(shè)備

P/ACE MDQ 毛細管電泳儀及非涂層石英毛細管，購于美國Beckman Coulter 公司；CF16RXⅡ高速冷凍離心機，購于日本Hitachi Koki 公司；1300SeriesⅡ生物安全柜，購于美國Thermo Forma公司；Scepter 2.0 手持式細胞計數(shù)器，購于美國Molecular Devices 公司；NU-8500 二氧化碳培養(yǎng)箱，購于美國NUAIRE 公司；DMI3000B 熒光倒置顯微鏡，購于美國Leica 公司；VCX750 超聲破碎儀，購于美國Sonics&Materials 公司；Costar3470培養(yǎng)平板，購于美國Coming 公司。

1.3 方法

1.3.1 河蜆湯、河蜆湯納米膠粒樣品制備 將粗制的河蜆湯經(jīng)5 000 g 離心10 min 后，得到的上清液即為河蜆湯樣品（Clam soup）。取上述河蜆湯置于100 ku 超濾離心管內(nèi)，4 ℃下5 000 g 離心30 min，超純水重懸離心3 次，最終截留部分重懸即可得到河蜆湯納米膠粒（UF-NPs），濾過部分即為河蜆湯超濾濾過液（UF-solution）。3 個樣品凍干后置于-30 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 原代大鼠巨噬細胞的提取與純化 將大鼠脫頸處死后，在75%酒精中浸泡3 min，注射DMEM 培養(yǎng)基10 mL 于腹腔內(nèi)，輕柔大鼠腹部3 min，靜置7 min。在無菌條件下剪開大鼠腹腔，小心吸取腹腔液體至離心管中。以2 000 r/min，23℃水平離心5 min，去上清，加10 L 巨噬細胞培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至25 mm 培養(yǎng)皿后置于37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)。待巨噬細胞基本貼壁后，用PBS 沖洗2～3 次，再重新加入培養(yǎng)基置于恒溫箱中培養(yǎng)，達到純化巨噬細胞的目的。試驗遵照浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物護理和使用委員會的標準進行（編號：No.2016R10031）。

1.3.3 巨噬細胞懸浮液制備 用2.5%胰酶消化液消化培養(yǎng)皿中的巨噬細胞，以2 000 r/min，23℃水平離心5 min，去上清，再加入含4.6%葡萄糖的0.02 mol/L，pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液離心洗滌2次，最終通過細胞計數(shù)器制備不同細胞濃度的巨噬細胞懸浮液。為了保持活細胞的表面特性，須每次試驗前新鮮制備細胞懸液。

1.3.4 巨噬細胞與河蜆湯中組分的相互作用 稱取河蜆湯、UF-NPs 和UF-solution 凍干粉，用DHank's 細胞平衡液配置成質(zhì)量濃度為3，1，2 mg/mL 的溶液，過0.22 μm 無菌過濾膜。將3 種樣品加入已貼壁24 h 的巨噬細胞培養(yǎng)皿中，細胞濃度為300×104個/mL，置于培養(yǎng)箱中共孵育。

1.3.5 電泳條件 毛細管在第1 次運行前用甲醇、1 mol/L NaOH、水、運行緩沖液分別沖洗5，30，10，20 min；樣品間用0.1 mol/L NaOH、水、運行緩沖液分別沖洗3，5，10 min。

1.3.5.1 河蜆湯、河蜆湯納米膠粒和河蜆湯超濾濾過液電泳條件[16]非涂層石英毛細管柱62 cm×50 μm，有效長度52 cm；運行緩沖液為0.05 mol/L 硼酸硼砂緩沖液，pH 8.7；分離電壓20 kV，壓力（0.5 psi）進樣10 s，分離柱溫25 ℃；紫外檢測波長214 nm。

1.3.5.2 巨噬細胞電泳條件 非涂層石英毛細管柱65 cm×150 μm，有效長度58 cm；運行緩沖液為：分離電壓15 kV，壓力（0.3 psi）進樣15 s，分離柱溫25 ℃；紫外檢測波長280 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 巨噬細胞的毛細管電泳行為

巨噬細胞的緩沖液條件參考Lu 等[4]，選定含4.6%葡萄糖的0.02 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）。由于細胞濃度會直接影響巨噬細胞的聚集程度和進樣量，從而影響巨噬細胞的毛細管電泳表現(xiàn)。試驗配制5 個不同濃度的巨噬細胞懸浮液，分別為5×104，10×104，30×104，60×104，150×104個/mL（依濃度換算進樣細胞個數(shù)為32，64，191，382，955個），考察巨噬細胞的毛細管電泳行為，結(jié)果見圖1。

通過對比150×104個/mL 高濃度細胞破碎前后的毛細管電泳圖（圖1e、1f）可知，正常的巨噬細胞會出現(xiàn)多個紫外吸收峰，而破碎后的巨噬細胞僅在6～7 min 出現(xiàn)了吸收值低且拖尾嚴重的小峰，這可能是大量的細胞碎片和細胞內(nèi)容物造成的，故證明毛細管電泳可以有效地區(qū)分完整的巨噬細胞和細胞碎片。

從圖1a～圖1e 可以看出，細胞濃度會影響細胞的遷移時間和出峰個數(shù)，其中細胞的遷移時間隨著巨噬細胞濃度的增加而延長，范圍在7～13 min 之內(nèi)，這說明巨噬細胞濃度與巨噬細胞的毛細管電泳行為間存在高度響應(yīng)性。同時，細胞存在遷移時間不穩(wěn)定、出峰個數(shù)易變的特點，分析原因可能是因為細胞聚集導(dǎo)致表面電位改變[17]，不同細胞周期的細胞表面帶電性不同[18-19]，細胞與毛細管的吸附等。這一現(xiàn)象說明了高靈敏度的毛細管電泳可以檢測到巨噬細胞群體中細微差異，也符合動物組織分離制得的原代細胞往往包含處于不同周期或分化狀態(tài)的細胞個體。原代分離的巨噬細胞常常同時包含M1 和M2 兩種活化類型，毛細管電泳中的多個細胞峰是否對應(yīng)不同活化類型的細胞，有待進一步研究確認。

圖1 不同濃度的巨噬細胞毛細管電泳圖Fig.1 Electropherogram of different concentration of macrophages by CE

2.2 巨噬細胞與河蜆湯組分的相互作用

2.2.1 巨噬細胞-河蜆湯混懸液中可溶性成分的變化 河蜆湯中組分與巨噬細胞共同培養(yǎng)2 h后，小心吸取上清液，4 ℃下2 000 r/min 離心10 min，采用毛細管電泳分離分析上清的成分，結(jié)果如圖2所示。

從圖2c 可知，河蜆湯納米膠粒在毛細管電泳中遷移時間為4.6 min，與前期研究結(jié)果一致[16]。采用激光動態(tài)光散射儀測得UF-NPs 的平均水合粒徑和Zeta 電位分別為（69.6±0.8）nm 和（-13.4±0.6）mV，光散射成像法（Nanosight NS300）測定納米膠粒數(shù)量為（43.2±0.6）×108particles/mL。

比較河蜆湯與巨噬細胞作用前后的電泳圖譜，可知河蜆湯與巨噬細胞混懸液中的成分既有原生成分的減少或消失（以數(shù)字1、2、3 表示），也生成了一些新成分（以字母A、B、C、D 表示）。河蜆湯及其超濾濾過液中的1、2、3 號物質(zhì)的紫外吸收峰面積明顯減少，其中2 號完全消失，河蜆湯納米膠粒中的2 號物質(zhì)也出現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，表明巨噬細胞吞噬吸收了河蜆湯中的組分。前期研究已知經(jīng)分子篩色譜分離的河蜆湯中的大分子組分（蛋白多糖）和小分子組分，在湯的毛細管電泳分離中的泳動時間分別為7.5～9.5 min 和4.3 min[16]；對照圖2 可知，1 號組分為河蜆湯的小分子成分，2、3 號組分為湯中的大分子組分。其中，2 號組分在超濾分離的河蜆湯伴生納米膠粒中也少量存在，其分子質(zhì)量應(yīng)該接近超濾截留的分子質(zhì)量10 ku，又根據(jù)河蜆湯納米膠粒的主要成分為蛋白多糖[15]，湯中很可能存在這類蛋白多糖單體，推測具有紫外吸收且分子質(zhì)量較大的2 號組分可能是蛋白多糖單體。1 號和3 號組分究竟為何種化合物，尚有待進一步研究。

圖2 河蜆湯（a）、河蜆湯超濾濾過液（b）、河蜆湯納米膠粒（c）與巨噬細胞作用2 h 前后的毛細管電泳圖Fig.2 Electropherogram of clam soup（a），UF-solution（b），UF-NPs（c）interact with macrophages before and after 2 h

作用2 h 后的混懸液出現(xiàn)了原本不存在的新物質(zhì)A、B、C、D，表明在短時間內(nèi)河蜆湯中組分即可刺激巨噬細胞分泌新的物質(zhì)，或被細胞降解、代謝產(chǎn)生新的物質(zhì)。河蜆湯的主成分為蛋白和多糖[15]，可刺激巨噬細胞產(chǎn)生多種細胞因子[20-21]，新物質(zhì)A、B、C、D 是否為細胞因子尚有待進一步研究。

2.2.2 巨噬細胞-河蜆湯混懸液中納米膠粒的變化 為了進一步研究巨噬細胞對河蜆湯組分的吞噬情況，用無血清的DMEM 培養(yǎng)基配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的河蜆湯納米膠粒，加入已貼壁24 h的巨噬細胞培養(yǎng)皿中，細胞濃度為300×104個/mL。置于培養(yǎng)箱中分別孵育24 h 和48 h 后，小心吸取上清液置于超濾管中，4 ℃下5 000 g 離心至溶液全部透過，用硼酸硼砂運行緩沖液重懸后，利用毛細管電泳進行檢測，結(jié)果如表1所示。

表1 與巨噬細胞作用24 h 和48 h 后河蜆湯超濾截留納米膠粒變化情況Table 1 The modification of UF-NPs with macrophage for 24 h and 48 h

試驗結(jié)果表明，河蜆湯納米膠粒與巨噬細胞長時間作用后，峰面積值明顯減少。24 h 后峰值減少6%，細胞吞噬納米膠粒的數(shù)量約為8.7×102particles/cell，48 h 后峰面積值減少15%，細胞吞噬納米膠粒數(shù)量約為2.13×103particles/cell。由此可知，48 h 內(nèi)巨噬細胞對河蜆湯中納米膠粒有持續(xù)性吞噬的作用。Li 等[22]研究發(fā)現(xiàn)24 h 內(nèi)巨噬細胞對不同形態(tài)糖納米膠粒具有持續(xù)吞噬現(xiàn)象，其中球形納米膠粒的內(nèi)化數(shù)量顯著高于圓柱形，其內(nèi)化機制是通過氯氰菊酯和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，可為研究巨噬細胞吞噬河蜆湯納米膠粒的機制提供參考。

2.2.3 河蜆湯納米膠粒對巨噬細胞電泳行為的影響 將1.3.4 節(jié)中河蜆湯納米膠粒作用2 h 后的巨噬細胞，按1.3.3 節(jié)的方法制成20×104個/mL 和150×104個/mL 的細胞懸液，考察河蜆湯納米膠粒對巨噬細胞電泳行為的影響，如圖3所示。

圖3 巨噬細胞與河蜆湯納米膠粒作用2 h 前后的毛細管電泳圖譜Fig.3 Electropherogram of macrophages interact with UF-NPs before and after 2 h

從圖3 可知，河蜆湯納米膠粒作用2 h 后的巨噬細胞，與初始狀態(tài)的巨噬細胞相比，其電泳遷移率加快，遷移時間縮短。細胞在20×104個/mL 低濃度時，出峰時間提前2.42 min；在150×104個/mL高濃度時，巨噬細胞整體的出峰時間提前了2.24 min，具有一致性。細胞電泳淌度是表征細胞表面電荷的參數(shù)之一[23]，因此，細胞出峰時間改變的原因可能是巨噬細胞吞噬河蜆湯納米膠粒后，細胞膜電位發(fā)生變化，降低巨噬細胞的表面電荷，減小荷質(zhì)比而加快其電泳遷移率。

2.2.4 河蜆湯納米膠粒對巨噬細胞形態(tài)學(xué)的影響為了考察河蜆湯中組分對巨噬細胞的生長生理狀態(tài)及形態(tài)的影響，將質(zhì)量濃度為1 mg/mL 無血清DMEM 培養(yǎng)基配制的河蜆湯納米膠粒溶液，加入已貼壁24 h 的巨噬細胞培養(yǎng)皿中。置于培養(yǎng)箱中分別作用0，0.5，1，2 h 后進行顯微鏡觀察，結(jié)果如圖4所示。

圖4 巨噬細胞與河蜆湯納米膠粒作用前、后的形態(tài)變化（200×）Fig.4 The picture of macrophages' morphological changes at different time interact with UF-NPs（200×）

從圖4 可知，加入河蜆湯納米膠粒0.5，1，2 h后的巨噬細胞，在形態(tài)上與加入之前相比出現(xiàn)了顯著變化，細胞快速拉長并呈梭狀分化，這一現(xiàn)象表明河蜆湯納米膠粒能快速促進巨噬細胞的分化。巨噬細胞活化為M1 型和M2 型時，膜電位分別表現(xiàn)為增加（去極化）和減少（超極化），巨噬細胞拉長形變常常與M2 型活化有關(guān)；而河蜆湯納米膠粒具有消除自由基的活性，胞內(nèi)自由基水平的降低可引起細胞膜超極化而降低膜電位，這與上述細胞毛細管電泳遷移率的測定結(jié)果相一致。由此推斷，巨噬細胞在內(nèi)化河蜆湯納米膠粒后，被誘導(dǎo)活化為M2 型巨噬細胞[24-25]，可表現(xiàn)出炎癥抑制作用。這一推斷尚需進一步用特異性抗體標記等方法來確證。

綜上，毛細管區(qū)帶電泳可用于分析細胞與復(fù)雜食品體系中單體組分和納米級聚集體的相互作用；對比其它常用方法，如流式細胞術(shù)、酶聯(lián)免疫法、熒光染色法等[22]，具有樣品前處理簡單、分辨率高、快速無損等優(yōu)勢，并可同時測定細胞、食品組分各自在互作后的變化；但單獨使用毛細管區(qū)帶電泳，無法直接鑒定未知成分。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，原代大鼠巨噬細胞可被毛細管區(qū)帶電泳分離，操作簡單、方便快速、靈敏度高；但存在細胞遷移時間易受細胞濃度影響、出峰個數(shù)多、重現(xiàn)性不佳等問題，有待進一步研究解決。同時，毛細管區(qū)帶電泳可靈敏檢測河蜆湯組分與巨噬細胞作用前后的變化，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞會選擇性吸收河蜆湯中可溶性組分，持續(xù)內(nèi)吞湯中的自組裝納米膠粒，發(fā)生活化（可能為M2 型）而產(chǎn)生形態(tài)學(xué)改變，并影響細胞的毛細管電泳行為，同時在細胞上清中可檢測到4 種新生成分。

本研究證實毛細管電泳可用于包括溶質(zhì)與膠體顆粒在內(nèi)的食品多尺度組分與細胞互作過程的快速分析，表征二者各自的成分和表面荷電性的變化，是研究食品組分-人體相互作用的一種新方法，如與光散射、質(zhì)譜、特異性熒光標記等檢測手段聯(lián)用，則可以進一步提高方法的準確性，獲取更豐富的成分和細胞生理信息。