余 蔓，雷勇輝，孫燕飛，熊 杰，李 楊*

(1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003；2.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003)

昆蟲體內(nèi)棲息著一些特殊的內(nèi)生微生物，在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過程中，內(nèi)生微生物有利于昆蟲的適應(yīng)與生存，還對(duì)昆蟲的營(yíng)養(yǎng)代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、生殖行為、免疫抗病等生命過程產(chǎn)生重要影響(王愛靜等，2000，張振宇等，2017)。

昆蟲內(nèi)生酵母是昆蟲內(nèi)生微生物中的常見類群之一。近年來，在介殼蟲等昆蟲體內(nèi)先后發(fā)現(xiàn)許多內(nèi)生酵母新種(Heetal.，2013；Oliveiraetal.，2014；Renetal.，2015；Liuetal.，2016)。在東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有擲孢酵母屬Sporobolomyces和擬威爾嗜殺酵母屬Cyberlindnera(劉開平等，2018)。刺腿食蚜蠅IschiodonscutellarisFabricius體內(nèi)含有的酵母種群也十分豐富(米桃桃等，2019)。這些昆蟲內(nèi)生酵母菌具有特殊的生理生化特性，例如褐飛虱Nilaparvamlugens體內(nèi)含有一種酵母可將尿酸轉(zhuǎn)化為氨基酸供給宿主昆蟲營(yíng)養(yǎng)(侯云等，2013)，某些內(nèi)生酵母還具有分解木聚糖的特性(Oliveiraetal.，2014)。

馬蜂VespavelutinaSmith是一種廣泛分布的群居社會(huì)性昆蟲。馬蜂主要以鱗翅目幼蟲為食，因而可被應(yīng)用于有效防治棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHübner等農(nóng)業(yè)害蟲(李鐵生，1987)。最近有研究報(bào)道馬蜂腸道內(nèi)含有可抑制反枝莧Amaranthusretroflexus的11種絲狀真菌(張?zhí)N等，2015)。然而，截止目前，關(guān)于馬蜂內(nèi)生酵母的種類組成及多樣性研究，尚未見報(bào)道。本文以新疆石河子本地采集的馬蜂為材料，通過高通量測(cè)序技術(shù)分析了馬蜂內(nèi)生酵母種群組成，并對(duì)菌株進(jìn)行了分離純化和初步鑒定。本研究將為馬蜂內(nèi)生酵母的生理功能研究及酵母菌資源開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 馬蜂采集

2019年8月在新疆石河子西公園草坪上，用捕蟲網(wǎng)捕獲得30頭馬蜂，將捕獲的馬蜂裝入含乙醚的離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

(1)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯20.0%，葡萄糖2.0%，瓊脂2.0%，pH6.0(瑪依古麗·庫(kù)爾班等，2015)。

(2)生理生化培養(yǎng)基：參照2011年《The Yeast:A taxonomic study》的方法配制碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、糖類發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基、尿素培養(yǎng)基、無維生素培養(yǎng)基(周新麗等，2011)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1馬蜂內(nèi)生酵母高通量測(cè)序分析

挑選30頭馬蜂，浸泡在75%乙醇中30 min，在超凈工作臺(tái)用無菌水沖洗3次，加適量無菌水，用研缽研磨成勻漿，濾紙片過濾，再用0.45 μm過濾膜真空抽濾，最后將濾膜送至美吉公司測(cè)序。通過Illumina(MiSeq)平臺(tái)，以NL-1、NL-2測(cè)序引物進(jìn)行26S rDNA高通量測(cè)序(Robnettetal.，2013)。在97%的相似度下，利用軟件QIIME(v.1.8.0)統(tǒng)計(jì)樣品中每個(gè)操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)物種豐富度信息，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性分析，其中包括Shannon多樣性指數(shù)(Shannon diversity index)、Simpson多樣性指數(shù)(The Simpson index)、Chao1豐富度估計(jì)指數(shù)(The Chao1 estimator)、ACE豐富度估計(jì)指數(shù)(The ACE estimator)(焦晶凱等，2014)。

1.3.2可培養(yǎng)酵母的分離純化

將蟲體研磨勻漿，吸取1 mL液體，按梯度稀釋，取適當(dāng)稀釋度液體100 μL涂布于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～3 d，挑取初步確認(rèn)為酵母單菌落，平板劃線純化2～3次。將分離純化的酵母菌株置4℃斜面保藏。

1.3.3菌株鑒定

(1)觀察菌株菌落和細(xì)胞形態(tài)，并參照2011年《The Yeast :A taxonomic study》進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定(糖發(fā)酵、碳同化、無維生素培養(yǎng)試驗(yàn)等)。

(2)菌株經(jīng)液體培養(yǎng)后，收集菌體，采用buffer快速抽提法提取基因組DNA(郭奕惠等，2006)，以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增26S rDNA序列。PCR擴(kuò)增體系：ddH2O 14.75 μL，10×Taq buffer 2 μL，dNTP 1.5 μL，MgCl21 μL，上游引物NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGG AAAAG-3′)1 μL，下游引物NL-4(5′-GGTCCG TGTTTCAAGACGG-3')1 μL，模板DNA 2.5 μL，Taq酶0.25 μL。PCR條件：94℃ 10 min，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)條帶正確后，送至上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所得26S rDNA序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA-X軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬蜂內(nèi)生酵母高通量測(cè)序多樣性分析及Alpha多樣性分析

通過Illumina(MiSeq)平臺(tái)對(duì)馬蜂樣品中提取的DNA進(jìn)行26S rDNA高通量測(cè)序分析并優(yōu)化，通過OTU聚類分析，真菌的OTU數(shù)分別為11個(gè)門、25個(gè)綱、42個(gè)目、49個(gè)科、54個(gè)屬、60個(gè)種，未分類2個(gè)；與2011年《The Yeast :A taxonomic study》和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)新種對(duì)比后，并進(jìn)一步優(yōu)化分類鑒定，內(nèi)生酵母含有3個(gè)門、6個(gè)綱、7個(gè)目、8個(gè)科、10個(gè)屬、10個(gè)種(表1，表2)，酵母類OUT數(shù)在真菌OTU總數(shù)的所占比例大于或等于0.5%。

表1 各OTU上酵母類群統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表2 馬蜂內(nèi)生酵母類群屬水平分布情況

在屬的水平上，Cutaneotrichosporon為內(nèi)生酵母菌的優(yōu)勢(shì)屬，占70.05%，孢圓酵母屬Torulaspora占19.78%，Sporidiobolales-unclassified占5.88%，畢赤酵母屬Pichia占1.34%，而酵母菌屬Saccharomyces、Pseudozyma、擬威爾嗜殺酵母屬Cyberlindnera、黑粉菌屬Filobasidium、Pleurostylic和金擔(dān)子菌屬Aureobasidium占比例都小于1%。

在種的水平上，馬蜂內(nèi)生酵母共有10個(gè)種，其中，Cutaneotrichosporoncutaneum和Torulasporadelbrueckii及Sporidiobolalessp.為優(yōu)勢(shì)種，所占比例依次為54%、30%和9%，其余7個(gè)種所占比例較小，都小于2%(表3)；而Sporidiobolalessp.屬于未鑒定的種，很可能是一種酵母新種。總體上，馬蜂體內(nèi)內(nèi)生酵母種群組成多樣，且分布不均。

表3 馬蜂內(nèi)生酵母類群種水平分布情況

通過軟件QIIME(v.1.8.0)對(duì)樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析，結(jié)果如表4所示。ACE指數(shù)84.38456，Chao1指數(shù)76，表明馬蜂內(nèi)生酵母種群多樣性較高，豐富度較大；Shannon指數(shù)為0.619215，Simpson指數(shù)為0.681265，顯示內(nèi)生酵母種群均勻度適中。

表4 馬蜂內(nèi)生菌群微生物多樣性

2.2 可培養(yǎng)酵母菌株形態(tài)特征與生理生化特征

通過稀釋平板分離純化，獲得一株酵母菌，命名為MF-17菌株，經(jīng)菌落、細(xì)胞形態(tài)特征觀察，菌株MF-17菌落紅色圓形狀奶油質(zhì)地，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，側(cè)面凸起，細(xì)胞大小為5～10 μm，細(xì)胞形態(tài)呈卵圓形，無性生殖為單端芽殖(圖1)。

圖1 MF-17菌株的菌落和細(xì)胞形態(tài)

菌株MF-17的糖類發(fā)酵及其它生理生化指檢測(cè)結(jié)果如表5所示。在無維生素培養(yǎng)基上菌株MF-17不能生長(zhǎng)；菌株最高生長(zhǎng)溫度可達(dá)40℃；菌株因不產(chǎn)生尿素酶而不能分解利用尿素。糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株MF-17可分解利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而在以乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉等6種糖為碳源的培養(yǎng)基中卻不能產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

表5 MF-17菌株生理生化測(cè)定結(jié)果

碳源同化結(jié)果如表6所示，在有氧條件下，菌株MF-17可以利用半乳糖、麥芽糖、蔗糖、松三糖及甘油，而不能利用鼠李糖、棉子糖和阿拉伯糖。在無氧發(fā)酵和有氧狀態(tài)下，菌株對(duì)麥芽糖、蔗糖的分解利用能力存在差異，表明菌體在不同條件下對(duì)同一底物的分解利用可能存在多種不同的分解機(jī)制。對(duì)照菌種鑒定手冊(cè)，綜合形態(tài)特征及生理生化特征檢測(cè)結(jié)果，初步鑒定菌株MF-17屬于Metschnikowia。

表6 MF-17菌株碳源同化結(jié)果

2.3 基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以MF-17菌株基因組DNA為模板，以通用引物擴(kuò)增26S rDNA的D1/D2區(qū)，獲得序列為516 bp，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已知序列比對(duì)，結(jié)果顯示，MF-17菌株與菌株Metschnikowiapulcherrima(KY108494.1)序列同源性高達(dá)98.785 %。

利用MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，MF-17菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹上與M.pulcherrima(KY108494.1)菌株處于同一進(jìn)化分支，與基于生理生化特征的鑒定結(jié)果基本相符。綜合形態(tài)、生理生化特征及分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，可確定菌株MF-17為M.pulcherrima。

圖2 MF-17菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

迄今為止，高通量測(cè)序技術(shù)是研究特定生境微生物群落組成及物種多樣性的有效方法。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定新疆石河子的馬蜂內(nèi)生酵母種群組成及豐度，內(nèi)生酵母共10個(gè)屬，內(nèi)生酵母種類組成多樣，但具體種屬豐度相差較大。其中Cutaneotrichosporon為優(yōu)勢(shì)屬，占比70.05%。此外，在樣品中測(cè)得一種未能鑒定到種的酵母Sporidiobolalessp.，可能為潛在的酵母新種資源。

理論上，通過稀釋平板分離方法可分離昆蟲體內(nèi)的大多數(shù)或部分內(nèi)生酵母(米桃桃等，2019)，但本研究從馬蜂體內(nèi)未能分離獲得高通量分析結(jié)果顯示的酵母優(yōu)勢(shì)種。可能的原因是優(yōu)勢(shì)種內(nèi)生酵母對(duì)昆蟲體內(nèi)環(huán)境依賴性較強(qiáng)，在與自然生境條件明顯不同的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，酵母菌不能離體生長(zhǎng)(廖麗花，2018)；此外，也可能因?yàn)閮?nèi)生酵母對(duì)營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH、氧氣等可能有復(fù)雜而特殊需求，而用常規(guī)的PDA培養(yǎng)基分離方法不能獲得酵母菌培養(yǎng)物；再者，內(nèi)生酵母在離體培養(yǎng)條件下由于環(huán)境不適而生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致在一定短時(shí)間內(nèi)無法形成肉眼可見的單菌落，因而可能被忽略。

本研究從馬蜂體內(nèi)分離了一株內(nèi)生酵母MF-17菌株，鑒定為M.pulcherrima。菌株MF-17最高生長(zhǎng)溫度比對(duì)照菌株M.pulcherrima(KY108494.1)稍高，可能與長(zhǎng)期適應(yīng)昆蟲體內(nèi)特殊環(huán)境有關(guān)。據(jù)研究報(bào)道，M.pulcherrima屬于一種非釀酒酵母，分泌胞外酶能力強(qiáng)，多附生于植物體表，有拮抗植物病害的作用，也是使釀酒增香或變質(zhì)的因素(Esteve-Zarzosoetal.，1998；Schenaetal.，2000；Spadaroetal.，2002；Jollyetal.，2006)。也有少數(shù)報(bào)道在昆蟲或其它動(dòng)物體分離到M.pulcherrima，例如，果蠅體內(nèi)也含有梅奇酵母屬M(fèi)etschnikowia，且兩者有密切的聯(lián)系，利用這種關(guān)系可以研發(fā)引誘劑并參與到農(nóng)業(yè)病蟲害防治中(Hamby，2012)。本研究從馬蜂體內(nèi)也分離出了此屬酵母，后續(xù)可深入研究，挖掘其在植物病蟲害防治或果酒釀造方面可能的應(yīng)用潛力。

然而，平板分離獲得的M.pulcherrima并不存于先前的高通量測(cè)序結(jié)果顯示的10個(gè)酵母種之中。據(jù)推測(cè)，在高通量測(cè)序時(shí)，因PCR擴(kuò)增過程的微量堿基錯(cuò)配，高通量測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)偏差，可能導(dǎo)致某些酵母菌種未能檢測(cè)到(張帆等，2019)。此外，由于不同馬蜂個(gè)體內(nèi)生酵母種類存在差異或采樣批次不同，可能導(dǎo)致高通量測(cè)序樣品和分離樣品存在差異。其實(shí)，平板分離純化獲得菌與高通量分析結(jié)果不一致的情況，在其他類似研究也屢次被報(bào)道。最近有研究揭示在二月蘭Orychophragmusviolaceus、龜甲飲片中分離真菌與高通量測(cè)序分析結(jié)果不盡相符(張帆等，2019，肖博文等，2020)。高通量測(cè)序分析法與平板分離法相結(jié)合，才可能相對(duì)較全面準(zhǔn)確地認(rèn)識(shí)昆蟲內(nèi)生微生物種群構(gòu)成及豐富度分布特點(diǎn)。嚴(yán)格地說，由于本研究采集的馬蜂樣品有限，實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然并不能全面準(zhǔn)確地反映馬蜂內(nèi)生酵母的種群組成實(shí)際情況，但在一定程度上，也體現(xiàn)了馬蜂內(nèi)生酵母組成的多樣性特點(diǎn)。本研究通過平板分離方法只分離得到的一株內(nèi)生酵母菌株，在后續(xù)研究中，可考慮模擬內(nèi)生菌自然生境條件，通過對(duì)培養(yǎng)基、生長(zhǎng)溫度、pH等條件優(yōu)化，有望分離到更多的內(nèi)生酵母。