梁會(huì)娟任志芳劉 偉張彥忠

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)辦公室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.濮陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 濮陽(yáng) 457000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一種常見(jiàn)的慢性肝損傷的傷口愈合反應(yīng)，是慢性肝病最終發(fā)展為肝硬化或肝細(xì)胞癌的重要病理過(guò)程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞，正常肝中HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝受到異常刺激時(shí)，HSC活化、增殖并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，導(dǎo)致肝ECM合成和降解失衡，促進(jìn)HF形成[1]。因此，如何有效的抑制HSC增殖，誘導(dǎo)其凋亡是防治HF的重要措施。冬凌草甲素是從冬凌草中分離得到的二萜類化合物，具有抗炎、抗癌、神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)功能[2－3]。有文獻(xiàn)報(bào)道冬凌草甲素可誘導(dǎo)HSC凋亡和周期阻滯，抑制內(nèi)源性和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)誘導(dǎo)的ECM合成，是一種潛在的預(yù)防HF藥物[4]。然而，冬凌草甲素抗HF的潛在分子機(jī)制并未完全闡明。泛素結(jié)合酶9(ubiquitin Conjugating Enzyme 9，UBC9)是小泛素樣分子相關(guān)修飾物(small ubiquitin-like molecular related modifiers，SUMO)泛素化過(guò)程的唯一接合酶，研究顯示UBC9參與HSC凋亡過(guò)程，下調(diào)UBC9可抑制HF進(jìn)程[5]。但冬凌草甲素能否調(diào)控UBC9影響HF進(jìn)程尚未可知。本研究以UBC9為切入點(diǎn)，探討冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖、凋亡的影響和分子機(jī)制，以期為冬凌草甲素用于臨床防治HF提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6購(gòu)于美國(guó)模式生物保藏中心。

1.2 主要試劑與儀器

杜爾伯格伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；冬凌草甲素(批號(hào)111721-201704，純度≥99.7%)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；UBC9小干擾RNA(UBC9 small interfering RNA，si-UBC9)及其陰性對(duì)照(small interfering RNA nagative control，si-NC)、UBC9過(guò)表達(dá)載體(UBC9 overexpression vector， pcDNA-UBC9)、空載體(Empty vector plasmid，pcDNA)由上海吉瑪制藥公司提供；凋亡試劑盒、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司；山羊抗兔二抗、兔源UBC9抗體、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、p21、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl相關(guān)X蛋白(Bcl associated x protein，Bax)抗體購(gòu)于上海賽信通生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于大連TaKaRa生化科技公司；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

復(fù)蘇HSC-T6細(xì)胞后，用含1%青鏈霉素雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度為70%~80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞密度到80%時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。分別采用冬凌草甲素濃度為10、20、40μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞48 h，依次記為冬凌草甲素-低組、冬凌草甲素-中組、冬凌草甲素-高組[6]。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組即正常培養(yǎng)的HSCT6細(xì)胞。按照下述方法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞增殖、凋亡、增殖凋亡相關(guān)蛋白、UBC9的表達(dá)水平。

為證實(shí)冬凌草甲素對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡的影響與調(diào)控UBC9表達(dá)有關(guān)，將HSC-T6細(xì)胞分為si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-UBC9組(轉(zhuǎn)染si-UBC9)、冬凌草甲素＋pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA后用含40 μmol/L冬凌草甲素的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育48 h)、冬凌草甲素＋pcDNA-UBC9組(轉(zhuǎn)染pcDNA-UBC9后用含40μmol/L冬凌草甲素的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育48 h)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

取5×103個(gè)對(duì)數(shù)期HSC-T6細(xì)胞接種96孔板，當(dāng)細(xì)胞貼壁后，按照上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)處理后，加入20μL MTT試劑，反應(yīng)4 h，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，再加入150μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，當(dāng)結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm處的吸光度(absorbance，A)值。細(xì)胞增殖抑制率＝[(A對(duì)照孔－A實(shí)驗(yàn)孔)/(A對(duì)照孔－A空白孔)]×100%

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

用適量結(jié)合緩沖液重懸各組HSC-76細(xì)胞，向500μL細(xì)胞懸液中添加5μL的Annexin V-FITC、5 μL的PI溶液，混合均勻后，室溫避光條件下反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.4 蛋白質(zhì)印記(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

使用RIPA裂解液對(duì)各組HSC-T6細(xì)胞進(jìn)行裂解。制備十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠。將蛋白樣品與適量上樣緩沖液混勻，沸水浴加熱3 min變性蛋白。取30μg蛋白樣品上樣后100 V電泳90 min分離蛋白樣品，濕法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜后，置于5%脫脂牛奶中4℃封閉過(guò)夜。置于稀釋的一抗溶液中室溫反應(yīng)2 h；置于二抗稀釋液中孵育1 h。顯影后用凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白(內(nèi)參為GAPDH)的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測(cè)UBC9 mRNA表達(dá)水平

TRIzol試劑提取各組HSC-76細(xì)胞總RNA，以逆轉(zhuǎn)合成的cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。2－ΔΔCt法分析UBC9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列(5’-3’):UBC9上游GGAAGTCCCGAGACAAAGGG，下游CAGCCACGAA ACCAAATGGG，GAPDH上游TGGACCAAGTACAT GAACCACC，下游CTGGTGATTGGACACGGTGA。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組間統(tǒng)計(jì)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響

與對(duì)照組比較，冬凌草甲素-低、-中、-高劑量組HSC-T6細(xì)胞CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞抑制率、p21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，且冬凌草甲素對(duì)HSC-T6細(xì)胞增殖和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響具有劑量依賴性。見(jiàn)表1和圖1。

表1 冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 1 Effect of Oridonin on the proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表1 冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 1 Effect of Oridonin on the proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對(duì)照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素-低組相比，＃P<0.05；與冬凌草甲素-中組相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分組Groups抑制率(%)Inhibition ratio CyclinD1 CyclinD1 p對(duì)照組Control group 0.00±0.03 0.64±0.冬凌草甲素-低組Oridonin-low group 11.25±1.17* 0.52±0.冬凌草甲素-中組Oridonin-medium group 28.36±2.74*＃ 0.39±0.冬凌草甲素-高組Oridonin-high group 49.68±4.33*＃＆ 0.24±0.203.542 41.244 F蛋白rotein p21蛋白p21 protein 06 0.20±0.02 05* 0.33±0.03*04*＃ 0.46±0.04*＃03*＃＆0.59±0.05*＃＆ 62.593 P 0.000 0.000 0.000?

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of proliferation-related proteins

2.2 冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響

與對(duì)照組比較，冬凌草甲素-低、-中、-高劑量組HSC-T6細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax蛋白表達(dá)、凋亡率顯著升高(P<0.05)，且冬凌草甲素對(duì)HSC－T6細(xì)胞凋亡和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響具有劑量依賴性。見(jiàn)表2和圖2。

圖2 冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響Figure 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表2 冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表2 冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對(duì)照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素-低組組相比，＃P<0.05；與冬凌草甲素-中組組相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分組Groups凋亡率(%)Apoptosis rate Bcl-2蛋白Bcl-2 protein Bax蛋白Bax protein對(duì)照組Control group 7.32±0.71 0.77±0.07 0.29±0.03冬凌草甲素-低組Oridonin-low group 11.65±1.23* 0.64±0.06* 0.44±0.04*冬凌草甲素-中組Oridonin-medium group 17.32±1.65*＃ 0.52±0.04*＃ 0.56±0.05*＃冬凌草甲素-高組Oridonin-high group 22.14±2.19*＃＆ 0.36±0.03*＃＆ 0.68±0.06*＃＆52.834 33.264 38.826 P 0.000 0.000 0.000 F

2.3 冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6中UBC9表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，冬凌草甲素-低、-中、-高劑量組HSC-T6細(xì)胞UBC9 mRNA和UBC9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，冬凌草甲素對(duì)UBC9 mRNA和UBC9蛋白表達(dá)的影響具有依賴性。見(jiàn)表3和圖3。

圖3 UBC9蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of UBC9 protein

表3 冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6中UBC9表達(dá)的影響(±s，n＝3)Table 3 Effects of Oridonin on UBC9 expression in rat hepatic stellate cells HSC-T6

表3 冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6中UBC9表達(dá)的影響(±s，n＝3)Table 3 Effects of Oridonin on UBC9 expression in rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對(duì)照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素-低組組相比，＃P<0.05；與冬凌草甲素-中組組相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分組Groups UBC9 mRNA UBC9蛋白UBC9 protein對(duì)照組Control group 1.00±0.05 0.84±0.08冬凌草甲素-低組Oridonin-low group 0.75±0.07* 0.71±0.06*冬凌草甲素-中組Oridonin-medium group 0.63±0.06*＃ 0.56±0.04*＃冬凌草甲素-高組Oridonin-high group 0.49±0.04*＃＆ 0.41±0.03*＃＆F 44.532 33.216 P 0.000 0.000

2.4 干擾UBC9表達(dá)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響

與si-NC組比較，si-UBC9組HSC-T6細(xì)胞UBC9蛋白表達(dá)顯著降低，表明HSC-T6細(xì)胞中UBC9表達(dá)受到抑制。抑制UBC9表達(dá)后，HSC-T6細(xì)胞CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，增殖抑制率、p21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4和圖4。

表4 干擾UBC9表達(dá)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 4 Effects of inference with UBC9 expression on proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表4 干擾UBC9表達(dá)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 4 Effects of inference with UBC9 expression on proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與si-NC組相比，*P<0.05。Note.Compared with si-NC group，*P<0.05.

分組Groups UBC9蛋白UBC9 protein抑制率(%)Inhibition ratio CyclinD1蛋白CyclinD1 protein p21蛋白p21 protein陰性對(duì)照si-NC 0.83±0.07 6.33±0.61 0.62±0.06 0.22±0.02干擾UBC9表達(dá)組si-UBC9 0.39±0.04* 41.58±4.22* 0.28±0.03* 0.55±0.05*t 9.453 14.319 8.779 10.614 P 0.001 0.000 0.001 0.000

圖4 UBC9和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 4 Expression of UBC9 protein

2.5 干擾UBC9表達(dá)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響

抑制UBC9表達(dá)后，HSC-T6細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表5和圖5。

表5 干擾UBC9表達(dá)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表5 干擾UBC9表達(dá)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與si-NC組相比，*P<0.05。Note.Compared with si-NC group，*P<0.05.

圖5 干擾UBC9表達(dá)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響Figure 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

2.6 過(guò)表達(dá)UBC9逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素(40μmol/L)對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖和凋亡的作用

與對(duì)照組比較，冬凌草甲素組HSC-T6細(xì)胞CyclinD1、Bcl-2和UBC9蛋白表達(dá)顯著降低，p21和Bax蛋白表達(dá)、增殖抑制率、凋亡率顯著升高；與冬凌草甲素＋pcDNA組比較，冬凌草甲素＋pcDNAUBC9組HSC-T6細(xì)胞CyclinD1、Bcl-2和UBC9蛋白表達(dá)顯著升高，p21和Bax蛋白表達(dá)、增殖抑制率、凋亡率顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表6和圖6。

表6 UBC9過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖和凋亡的作用(±s，n＝3)Table 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表6 UBC9過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖和凋亡的作用(±s，n＝3)Table 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對(duì)照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素＋pcDNA組相比，＃P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin＋pcDNA group，＃P<0.05.

分組Groups UBC9蛋白UBC9 protein抑制率(%)Inhibition ratio凋亡率(%)Apoptosis rate CyclinD1蛋白CyclinD1 protein p21蛋白p21 protein Bcl-2蛋白Bcl-2 protein Bax蛋白Bax protein對(duì)照組Control group 0.82±0.07 0.00±0.02 6.32±0.63 0.63±0.06 0.21±0.02 0.78±0.07 0.27±0.03冬凌草甲素Oridonin 0.41±0.04* 47.21±4.33* 21.62±2.13* 0.23±0.03* 0.57±0.05* 0.35±0.03* 0.67±0.06*冬凌草甲素＋pcDNA Oridonin＋pcDNA 0.38±0.03 48.65±4.72 23.58±2.36 0.22±0.02 0.58±0.06 0.34±0.03 0.69±0.07冬凌草甲素＋pcDNA-UBC9 Oridonin＋pcDNA-UBC9 0.71±0.07＃ 20.11±2.03＃ 11.28±1.14＃ 0.52±0.05＃ 0.33±0.03＃ 0.67±0.06＃ 0.39±0.04＃F 46.634 145.099 69.359 69.514 54.203 58.447 47.236 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖6 UBC9過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了冬凌草甲素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖和凋亡的作用Figure 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

3 討論

冬凌草甲素是東亞地區(qū)常用中草藥冬凌草的天然活性成分，近年來(lái)因其廣泛的生物活性和治療多種疾病的潛力而受到越來(lái)越多的關(guān)注。研究顯示，冬凌草甲素通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖、觸發(fā)自噬、誘導(dǎo)凋亡、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展等機(jī)制對(duì)肝癌[7]、膽管癌[8]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[9]等多種類型惡性腫瘤表現(xiàn)出抗腫瘤作用，是潛在的癌癥候選治療藥物。冬凌草甲素還可抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織中平滑肌肌動(dòng)蛋白和I型膠原蛋白表達(dá)，減輕肺泡空間塌陷、肺氣腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，防治肺纖維化病變[10]。此外，冬凌草甲素還可通過(guò)促進(jìn)P21相關(guān)的自噬來(lái)預(yù)防心肌肥大[11]。本研究探討冬凌草甲素的抗HF作用發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素可顯著抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并呈顯著的量效依賴關(guān)系，與Bohanon等[4]研究結(jié)果相吻合。CyclinD1和P21細(xì)胞增殖過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，P21通過(guò)抑制周期素依賴激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)/CyclinD1復(fù)合物活性，抑制G1-S期相變發(fā)揮抗增殖作用[12]。Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡調(diào)控中重要的蛋白，Bax表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)降低可促進(jìn)線粒體膜通透性改變，抑制孔道開(kāi)放以及抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，抑制Caspases活化進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生[13]。本研究顯示，冬凌草甲素呈劑量依賴性抑制CyclinD1、Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)P21、Bax表達(dá)，這提示冬凌草甲素可能通過(guò)調(diào)控CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白抑制HSC-T6增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

UBC9是UBC家族的重要成員，其通過(guò)促使活化的SUMO與目標(biāo)蛋白接合，進(jìn)而介導(dǎo)SUMO發(fā)揮蛋白調(diào)節(jié)作用，是纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[14]。研究顯示，在腎臟纖維化過(guò)程中UBC9表達(dá)上調(diào)[15]。沉默UBC9通過(guò)抑制早幼粒細(xì)胞白血病蛋白類泛素化可降低主動(dòng)脈縮窄小鼠心肌纖維化的發(fā)展，并部分改善其心功能[16]。在活化的人HSC細(xì)胞LX-2中UBC9表達(dá)顯著上調(diào)，沉默UBC9可明顯抑制HSC增殖，降低平滑肌肌動(dòng)蛋白和Ⅰ型膠原的表達(dá)水平，進(jìn)而阻止HF[17]。此外，多種肝癌細(xì)胞中UBC9亦呈高表達(dá)，干擾UBC9表達(dá)可明顯降低肝癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，提高其凋亡水平[18－19]。為探討UBC9在冬凌草甲素抗HF中的作用，本研究檢測(cè)冬凌草甲素干預(yù)后HSC-T6細(xì)胞中UBC9表達(dá)水平，結(jié)果顯示冬凌草甲素呈劑量依賴性抑制UBC9表達(dá)水平，提示UBC9表達(dá)下調(diào)可能與冬凌草甲素的抗HF作用有關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，轉(zhuǎn)染si-UBC9干擾UBC9表達(dá)對(duì)HSC-T6細(xì)胞亦具有顯著的增殖抑制和凋亡作用。此外，本研究顯示過(guò)表達(dá)還能夠逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)HSC-T6細(xì)胞的增殖、凋亡以及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，提示冬凌草甲素對(duì)HSC-T6細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用抑制UBC9表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，冬凌草甲素可抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而具有預(yù)防HF的潛在價(jià)值，其機(jī)制與抑制UBC9表達(dá)有關(guān)，這為開(kāi)發(fā)冬凌草甲素用于臨床防治HF奠定了理論基礎(chǔ)。