東淑珍，石翊颯，師永倩，金平

蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000

甘珀酸（carbenoxolone，CBX）是一類非特異性的縫隙連接（gap junction，GJ）阻滯劑，近年研究發(fā)現(xiàn)，CBX 對疼痛有明顯的緩解作用，其機制可能是通過減少縫隙連接蛋白43（connexins 43，Cx43）的表達及磷酸化發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［1］，也可能是通過抑制縫隙連接蛋白1（pannexin 1，PX1）的表達，減少星形膠質(zhì)細胞對ATP 的攝取及細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［2］。

有報道表明，縫隙連接蛋白（connexin，Cx）在慢性疼痛中發(fā)揮重要作用，且有可能成為新一代鎮(zhèn)痛藥物的靶點［3］。不同于 Cx，PX 的細胞外環(huán)上有 2 個半胱氨酸殘基，而Cx 的細胞外環(huán)上有3 個半胱氨酸殘基［4-5］。PX1 以一種半通道單體的形式存在，允許ATP、Ca2+等小分子通過，從而參與星形膠質(zhì)細胞的激活［6-7］。在炎癥性和神經(jīng)性疾病中，星形膠質(zhì)細胞被激活，表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細胞增殖并增加其活化標志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表達。CBX 對PX1 的阻斷作用是通過與PX1 的六聚體結(jié)合并關(guān)閉其通道作用，從而阻斷鈣離子及其他信號分子的內(nèi)流。PX1 在星形膠質(zhì)細胞表面高表達，參與星形膠質(zhì)細胞的激活。本研究通過建立大鼠切口痛模型，探討CBX 對大鼠切口痛的影響及PX1 在其發(fā)生機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 CBX（A8389）及CBX 抑制劑10 panx（A2700）購自美國 APExBIO 公司；兔抗 GFAP多克隆抗體（Ab-BF0345）購自美國Affinity 公司；鼠抗PX1 單克隆抗體（ab139715）購自美國Abcam 公司；鼠抗GAPDH 單克隆抗體（sc-365062）購自美國Santa Cruz Biotech-nology 公司；FITC 標記的山羊抗鼠IgG（H+L）（S007）、TRITC 標記的山羊抗兔 IgG（H +L）（S0015）及HRP 標記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG（R0020）購自美國 Proteintech 公司；Von Frey 纖維絲購自美國North Coast Medical 公司；Plantar Tes（t37370）購自意大利UGO BASILE 公司。

1.2 實驗動物 清潔級SD 大鼠，雄性，102 只，體重200 ~ 250 g，8 ~ 10 周齡，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供，動物合格證號為：62000600000518。所有實驗操作遵循國際疼痛學(xué)會相關(guān)指南，且通過蘭州大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會審核批準（D2019-064）。

1.3 動物分組及處理 將SD 大鼠隨機分為5 組：對照組、模型組、生理鹽水組、CBX 組（0.6 μg ／10 μL）、抑制劑組（1.25 μg ／ 10 μL），對照組 6 只，其他組每組24 只。生理鹽水組、CBX 組、抑制劑組大鼠于術(shù)前30 min，參考文獻［8］的方法經(jīng)鞘內(nèi)分別注射生理鹽水、CBX、CBX 抑制劑 10 panx，均 10 μL ／ 只，模型組不給藥；參考文獻［9］的經(jīng)典Brennan 法對大鼠分別進行趾部切口痛模型操作。對照組不給藥不進行手術(shù)處理。

1.4 行為學(xué)的測定

1.4.1 機械縮足閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）測定 參考文獻［10］方法。術(shù)前 30 min所有大鼠進行 MWT 檢測；術(shù)后 2、4、6、24 h，模型組、生理鹽水組、CBX 組、抑制劑組分別取6 只大鼠進行檢測，對照組于各時間點對6 只大鼠進行重復(fù)檢測。將大鼠置于底部為金屬網(wǎng)格的有機玻璃箱中適應(yīng)30 min，采用 Von Frey 纖維絲（0.4 ~ 15 g）通過金屬網(wǎng)格垂直刺激大鼠左后爪切口旁皮膚，使纖維絲持續(xù)彎曲并保持6 ~ 8 s，每次刺激間隔時間大于30 s。初始刺激強度2.0 g。若5 次刺激中出現(xiàn)3 次快速縮足或舔足反應(yīng)記為疼痛X，再給予低一級強度刺激；若少于3 次則記為0，再給予高一級強度刺激。直到出現(xiàn)不同的刺激反應(yīng)（記為X0 或0X）時，再連續(xù)檢測4 次，獲得有6 位字符，根據(jù)該6 位字符，通過von Frey 纖維絲陽性常數(shù)表查出常數(shù)κ（如OXOXOO =0.22）。同時記錄最后一次刺激強度，按下式計算50% MWT 值。

50% MWT =［10 Xf ＋ κδ］／ 10 000

式中Xf 為最末次測試的對數(shù)值，δ 為各刺激強度log 值相鄰間距和的平均數(shù)，此處常數(shù)κ 為0.175。

1.4.2 熱縮足潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）測定 參考文獻［11］方法。測定時間點及大鼠數(shù)量與1.4.1 項相同。將大鼠放于有機玻璃箱中適應(yīng)10 ~ 15 min，將熱輻射刺激儀熱源放在后爪切口旁所在的玻璃板下，測定縮腿潛伏期，即光照開始至發(fā)生縮腿反應(yīng)的時長，持續(xù)時間為30 s，保持同一刺激強度，重復(fù)測量3 次，取平均值，每次測量間隔5 min。

1.5 大鼠脊髓腰膨大中PX1 蛋白表達水平的檢測采用 Western blot 法。于術(shù)后 2、4、6、24 h 行為學(xué)檢測后，各組隨機取3 只大鼠，頸椎脫臼處死，立即摘取腰膨大，進行組織勻漿，冰上裂解15 min，16 099 ×g離心30 min；取上清液，經(jīng)10% SDS-PAGE 分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用含5%脫脂奶粉TBST 溶液于室溫封閉2 h；加入鼠抗PX1 單克隆抗體及鼠抗GAPDH 單克隆抗體（均 1 ∶800 稀釋），室溫搖床孵育 1 h，4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌 3 次，每次 10 min，加入HRP 標記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG（均1 ∶8 000 稀釋），室溫搖床孵育 2 h；TBST 洗滌 3 次，每次10 min，加入 ECL 發(fā)光液，曝光，應(yīng)用 Image J 軟件測定條帶平均光密度值。

1.6 大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞GFAP 與PX1 共表達情況的檢測 采用免疫熒光法。于術(shù)后2 h，行為學(xué)測試結(jié)束后，對照組、模型組、CBX 組、抑制劑組隨機各取3 只大鼠，用10%水合氯醛麻醉，暴露心臟并經(jīng)心尖穿刺主動脈置管，依次灌注生理鹽水250 mL和4%多聚甲醛500 mL，暴露并取出腰膨大，浸入4%多聚甲醛過夜；依次浸入20%、30%蔗糖溶液梯度沉底，冰凍切片；室溫下風干，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS 洗滌 3 次，每次 5 min，0.5% TritonX-100室溫通透 10 min；PBS 洗滌 3 次，每次 5 min，放入預(yù)熱95 ℃的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中，95 ~ 100 ℃溫度下加熱15 min，取出，冷卻后用PBS 洗滌3 次。每組切片分別加入兔抗GFAP 多克隆抗體和鼠抗PX1單克隆抗體（均 1 ∶100 稀釋），4 ℃孵育過夜；用 PBS洗滌3 次，每次5 min，加入FITC 標記的山羊抗鼠IgG（H + L）和 TRITC 標記的山羊抗兔 IgG（H + L）（均1 ∶100 稀釋），37 ℃孵育 1 h；用 PBS 洗滌 3 次，每次5 min，用 DAPI 溶液進行避光復(fù)染 8 min，PBS 洗滌3 次，加入熒光免疫淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 7.0 軟件制圖，SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均采用均數(shù) ± 標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗經(jīng)Dunnett分析，若不滿足方差齊性，采用Welch ANOVA分析；兩兩比較采用Games-Howell test。以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)的測定

2.1.1 MWT 各組大鼠術(shù)前MWT 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= 0.00 ~ 0.40，P> 0.05）。與對照組比較，模型組和生理鹽水組術(shù)后2、4、6 h 的MWT 明顯降低（t= 2.74 ~ 8.36，P< 0.001）；與模型組比較，生理鹽水組各時間點MWT 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-0.34 ~ 1.50，P> 0.05），CBX 組及抑制劑組術(shù)后2、4 h 的 MWT 均明顯升高（t= -10.22 ~ 6.82，P<0.001）；與CBX 組比較，抑制劑組各時間點的MWT差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= -2.00 ~ 2.16，P> 0.05）。見表1。

表1 不同時間點各組大鼠的 MWT（g，，n = 6）Tab.1 MWTs of rats in various groups at various time points（g，，n = 6）

表1 不同時間點各組大鼠的 MWT（g，，n = 6）Tab.1 MWTs of rats in various groups at various time points（g，，n = 6）

注：aaa 表示與對照組比較，P < 0.001；bbb 表示與模型組比較，P < 0.001。

組別 術(shù)前組別 術(shù)前30 min 24對照組 12.10 ± 3.47 12.78 ± 3.44 12.00 ± 3.31 12.11 ± 2.22 12.14 ± 2.73模型組 12.10 ± 3.47 02.03 ± 0.97aaa 00.97 ± 0.77aaa 01.73 ± 1.13aaa 08.05 ± 3.59生理鹽水組 12.78 ± 3.44 01.92 ± 1.09aaa 00.63 ± 0.35aaa 02.31 ± 0.63aaa 05.55 ± 1.96 CBX 組 12.00 ± 3.31 06.02 ± 1.06bbb 07.95 ± 1.48bbb 03.39 ± 1.72 06.34 ± 1.16抑制劑組 10.39 ± 3.59 07.00 ± 1.63bbb 05.94 ± 1.73bbb 02.43 ± 0.93 07.95 ± 1.58術(shù)后時間（h）2 4 6

2.1.2 TWL 各組大鼠術(shù)前TWL 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= -1.22 ~ 0.00，P> 0.05）；與對照組比較，模型組和生理鹽水組各時間點的TWL 明顯降低（t=5.20 ~ 61.88，P< 0.001）；與模型組比較，生理鹽水組間的TWL 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= -0.99 ~0.92，P> 0.05），CBX 組及抑制劑組 2、4、6 h 的TWL 均明顯升高（t分別為-12.25~3.13 和-12.54~6.92，P< 0.001）；與 CBX 組比較，抑制劑組術(shù)后 2和 24 h 的 TWL 明顯升高（t=-2.77~2.41，P<0.05）。見表2。

表2 不同時間點各組大鼠的 TWL（s，，n = 6）Tab.2 TWLs in various groups at various time points（s，，n = 6）

表2 不同時間點各組大鼠的 TWL（s，，n = 6）Tab.2 TWLs in various groups at various time points（s，，n = 6）

注：aaa 表示與對照組比較，P < 0.001；bbb 表示與模型組比較，P < 0.001；c 表示與 CBX 組比較，P < 0.05。

組別 術(shù)前30 min 24對照組 25.13 ± 0.69 24.73 ± 0.81 25.01 ± 0.98 25.14 ± 0.53 24.64 ± 0.68模型組 25.13 ± 0.69 05.54 ± 1.15aaa 03.32 ± 0.36aaa 05.98 ± 0.55aaa 09.17 ± 1.99aaa生理鹽水組 24.73 ± 0.81 06.07 ± 0.58aaa 03.32 ± 0.57aaa 06.39 ± 1.32aaa 09.12 ± 0.46aaa CBX 組 25.27 ± 0.69 13.76 ± 3.33bbb 17.08 ± 2.73bbb 13.53 ± 3.73bbb 18.74 ± 0.90抑制劑組 24.68 ± 0.65 18.57 ± 2.64bbb，c 15.82 ± 2.42bbb 13.77 ± 2.70bbb 20.96 ± 2.06c術(shù)后時間（h）2 4 6

2.2 大鼠脊髓腰膨大中PX1 蛋白的表達水平 與對照組比較，模型組和生理鹽水組術(shù)后各時間點PX1的表達水平明顯升高（t=-11.97~-4.63，P<0.05）；與模型組比較，生理鹽水組各時間點的PX1 表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.05~0.38，P>0.05），CBX組 2、4、24 h 的 PX1 表達水平明顯降低（t= 3.40 ~6.66，P< 0.05），抑制劑組 2、4、6、24 h 的 PX1 表達量明顯降低（t= 3.49 ~ 8.89，P< 0.05）；與抑制劑比較，CBX 組術(shù)后 2、6 h 的 PX1 蛋白表達水平明顯升高（t= -4.69 ~ 4.89，P< 0.05），4 h 的PX1 蛋白表達水平明顯降低（t= -4.69，P< 0.05）。見圖1 和圖2。

圖1 Western blot 法檢測大鼠脊髓腰膨大中PX1 蛋白的表達情況Fig.1 Western blotting of PX1 expression in lumbar segment of the spinal cord of rats

圖2 不同時間點各組大鼠脊髓腰膨大中PX1 蛋白的相對表達量Fig.2 Relative expression levels of PX1 in lumbar segment of the spinal cord of rats in various groups at various time points

2.3 大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞GFAP 與PX1 的共表達模型組的PX1 和星形膠質(zhì)細胞GFAP 共表達最明顯，CBX 組的共表達有所減少，抑制劑組減少最明顯，見圖3。

圖3 免疫熒光法檢測各組大鼠脊髓中PX1 與GFAP 的共表達（× 200）Fig.3 IFA of co-expression of PX1 and GFAP in lumbar segment of the spinal cord of rats in various groups（× 200）

3 討 論

本實驗采用Brennan 法建立經(jīng)典大鼠趾部切口痛模型，以大鼠患肢蜷縮或不能承重為模型建立成功。急性切口痛模型與臨床的術(shù)后疼痛相似，術(shù)后大鼠表現(xiàn)為痛覺過敏、自發(fā)性疼痛和誘發(fā)性疼痛。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠術(shù)后24 h 的MWT 呈降低趨勢，以術(shù)后4 h 最為明顯，與本課題組前期相關(guān)實驗結(jié)果一致［12］。有研究表明，CBX 主要用于緩解各種神經(jīng)病理性疼痛及炎性痛，同時參考多項研究結(jié)果，確定本實驗中CBX 及其抑制劑10 panx 的濃度分別為 0.6 和 1.25 μg ／ 10 μL［13-15］。

本實驗結(jié)果顯示，與術(shù)前比較，模型組和生理鹽水組術(shù)后24 h 內(nèi)PX1 的表達水平明顯增加，以術(shù)后6、24 h 最明顯（P< 0.05）；免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組的PX1 和星形膠質(zhì)細胞GFAP的共表達明顯，表明PX1 在急性疼痛的產(chǎn)生及維持過程中具有重要作用。行為學(xué)結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射CBX 后，大鼠術(shù)后 2、4 h 的 MWT 明顯升高（P<0.05）；Western blot 結(jié)果顯示，術(shù)前鞘內(nèi)注射CBX 能夠明顯減少PX1 的表達量，以術(shù)后4 h 阻斷效應(yīng)最為明顯（P< 0.05）；免疫熒光顯示，CBX 組術(shù)后 2 h 的 PX1和GFAP 的共表達有所減少，證明鞘內(nèi)注射CBX能夠通過減少PX1 的表達量及星形膠質(zhì)細胞的活化，從而緩解急性疼痛。

綜上所述，脊髓背角星形膠質(zhì)細胞表面的PX1在急性疼痛的產(chǎn)生及持續(xù)中發(fā)揮著重要作用，為后續(xù)研究新型鎮(zhèn)痛藥物提供了新的靶點。鞘內(nèi)注射CBX 能通過抑制PX1 及膠質(zhì)細胞的活化而明顯緩解急性疼痛，但其鎮(zhèn)痛效果短暫，需多次鞘內(nèi)注射給藥或鞘內(nèi)置管持續(xù)給藥以維持其效果。