陳宴霞，黃曼娜，邱立明，劉曼，藺慶輝

青島中科愛博生物科技有限公司，山東青島266400

β2-微球蛋白（β2-microglobμlin，β2MG）作為腎功能標志物是早期診斷腎病的一項重要生化指標［1-3］，在正常情況下，由于其體積小，通常在腎小球易過濾，并被腎臟的近端腎小管細胞分解代謝［4-5］，若腎功能受損，則血清中β2MG 就會升高。近年來，β2MG又作為多種腫瘤標志物備受眾多學(xué)者關(guān)注，由于惡性腫瘤細胞具有超強合成β2MG 的能力，在臨床上如腎癌、肺癌、乳腺癌、消化系統(tǒng)等惡性腫瘤患者血清中β2MG 含量超過正常范圍，已作為聯(lián)合檢測指標廣泛應(yīng)用于腫瘤診斷和監(jiān)測［5-8］。因此，臨床關(guān)于β2MG 的血清學(xué)檢測指標對于疾病診斷具有重要意義，值得大力推廣應(yīng)用。

β2MG 為一種低相對分子質(zhì)量蛋白，是由99 個氨基酸組成的單鏈多肽，在第25 和80 位半胱氨酸有1 個鏈內(nèi)二硫鍵，相對分子質(zhì)量大小為11 800，與免疫球蛋白具有序列同源性，特別是與IgG 分子的CH3 結(jié)構(gòu)域具有同源性［9］。鑒于其重要的臨床應(yīng)用價值，本研究旨在通過基因工程技術(shù)，利用兩種原核表達載體重組表達人β2MG，并分別對獲得的融合蛋白進行活性檢測，為后續(xù)免疫原的篩選及制備相應(yīng)的單克隆抗體創(chuàng)造條件，并為相關(guān)臨床診斷試劑盒的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株 原核表達載體pET-28a（+）（5 369 bp，His-tag）和 pET-32a（+）（5 900 bp，Trx-Histags）由馬來西亞Novagen 公司提供；E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞購自日本TaKaRa 公司。

1.2 主要試劑及儀器 質(zhì)粒小量提取試劑盒為德國Qiagen 公司產(chǎn)品；核酸回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；T4 DNA 連接酶購自德國Promage 公司；HRP 標記的兔抗羊IgG（檢測抗體）、TMB 顯色液和BSA 均購自北京索萊寶有限公司；羊源β2MG 多克隆抗體（捕獲抗體）購自深圳市菲鵬生物股份有限公司；Ni-NTA 樹脂為美國通用電氣（GE）公司產(chǎn)品。

1.3 不同表達載體重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過NCBI 網(wǎng)站下載 β2MG基因序列（NM_004048.4），去除信號肽，根據(jù)大腸埃希菌的優(yōu)勢密碼子進行基因優(yōu)化，使其利于在大腸埃希菌中表達。由于所選表達載體的5′端均有His 標簽，在基因3′端分別加入了終止子，避免過多不必要的末端表達，在優(yōu)化后基因序列兩端加入酶切位點（EcoRⅠ／ HindⅢ），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將合成序列進行酶切回收后，分別連接至 pET-28a（+）和 pET-32a（+）表達載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-28a（+）-β2MG和 pET-32a（+）-β2MG，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coliDH5α 中，分別進行 Kana（50 μg ／ mL）和 Amp（100 μg ／ mL）抗性 LB平板篩選培養(yǎng)，挑取陽性單克隆菌株，進行PCR 鑒定，陽性菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并進行序列比對確認。

1.4 重組表達菌株的構(gòu)建及目的基因的誘導(dǎo)表達 將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coliBL21（DE3）中，分別進行 Kana（50 μg ／mL）和 Amp（100 μg ／ mL）抗性LB 平板培養(yǎng)過夜，挑取長勢較好的單克隆菌株于LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液濃度（A600）達0.5 時，加入 IPTG（0.4 mmol ／L），分別于 25 及 37 ℃梯度誘導(dǎo)表達過夜。取1 mL 各菌液，10 000×g離心1 min，收集菌體，加入 600 μL 蛋白緩沖液（25 mmol／ L Tris-HCl，pH 8.5）重懸，于冰上利用超聲波破碎儀超聲破碎處理5 min（超聲3 s，關(guān)閉3 s，功率10 W），離心后分別取上清和沉淀，進行15% SDS-PAGE 分析，確定β2MG 在不同表達載體中表達的最佳誘導(dǎo)條件，其中pET-28a（+）載體的重組蛋白于37 ℃表達形式為 His-β2MG（相對分子質(zhì)量 15 000），pET-32a（+）載體的重組蛋白于25 ℃表達形式為Trx-Hisβ2MG（相對分子質(zhì)量30 000）。

1.5 重組β2MG 蛋白的擴大培養(yǎng)及純化 取5 mL 菌液，接種于500 mL LB 液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，按照最佳誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)表達過夜，4 500 ×g離心15 min，收集菌體，加入蛋白緩沖液（25 mmol ／ L Tris-HCl，pH 8.5）重懸，6 000 ×g離心 20 min，棄上清，加入蛋白緩沖液，超聲破碎處理30 min（超聲3 s，間隔5 s，功率 10 W），10 000 ×g離心 15 min，收集純上清表達菌株的上清液作為蛋白原液，直接過Ni 柱進行親和純化；若包涵體表達則收集沉淀部分，經(jīng)洗滌、尿素溶解后作為蛋白原液，進行Ni 柱親和純化。收集各梯度蛋白洗脫液，分別取10 μL，經(jīng)15%SDS-PAGE分析蛋白純度，合并主峰蛋白液進行透析復(fù)性。

1.6 兩種重組β2MG 蛋白活性的比較 采用間接ELISA 法。利用紫外分光光度法于nanodrop 儀測定蛋白濃度，加入酶標板（濃度為 25 μg ／ mL），4 ℃包被過夜；依次加入倍比稀釋的羊源β2MG 多克隆抗體及 HRP 標記的兔抗羊 IgG（1 ∶10 000 稀釋）作為一抗和二抗，37 ℃孵育1 h，使抗原抗體充分識別；加入100 μL TMB 顯色液顯色10 min；加入1% H2SO4溶液終止反應(yīng)。于酶標儀波長450 nm 處讀取吸光度值，比較不同載體表達的重組β2MG 蛋白之間的活性差異。

2 結(jié) 果

2.1 不同表達載體重組質(zhì)粒的鑒定 重組表達質(zhì)粒pET-28a（+）-β2MG和 pET-32a（+）-β2MG經(jīng) 2%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別可見5 666、6 197 bp 的重組質(zhì)粒片段，大小與預(yù)期相符；兩種重組質(zhì)粒β2MG基因的PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見297 bp 的特異性片段，大小與預(yù)期相符。見圖1。測序結(jié)果經(jīng)比對顯示，插入片段的基因序列與預(yù)期一致，未發(fā)生突變。

圖1 重組表達質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretic profile of recombinant plasmids

2.2 重組表達菌株的鑒定 15% SDS-PAGE 分析顯示，6 株 pET-28a（+）-β2MG／ BL21（DE3）重組菌在相對分子質(zhì)量約15 000 處有明顯的蛋白表達條帶，6株 pET-32a（+）-β2MG／ BL21（DE3）重組菌在相對分子質(zhì)量約30 000 處有明顯的蛋白表達條帶，大小均與理論值相符，見圖2。

圖2 重組表達菌株的鑒定Fig.2 Identification of recombinant bacterial strains

2.3 重組β2MG 蛋白的表達形式 15% SDS-PAGE分析顯示，兩種載體所表達的目的蛋白量相當(dāng)，約占總蛋白的 65%。pET-32a（+）-β2MG／ BL21（DE3）于37 ℃誘導(dǎo)的上清和沉淀均有目的蛋白表達，而25 ℃誘導(dǎo)可實現(xiàn)全部上清表達；pET-28a（+）-β2MG／BL21（DE3）表達的目的蛋白無論低溫或高溫誘導(dǎo)均以包涵體形式存在。見圖3。表明不同表達載體所表達的β2MG 溶解性不同。

圖3 重組β2MG 蛋白表達形式的SDS-PAGE 分析Fig.3 Analysis of form of recombinant β2MG protein by SDS-PAGE

2.4 純化蛋白的鑒定 15% SDS-PAGE 分析顯示，純化的重組β2MG 蛋白在相對分子質(zhì)量約15 000和 30 000 處分別可見 His-β2MG 和 Trx-His-β2MG特異性條帶，純度可達95%以上，見圖4。蛋白濃度約 3 mg ／ mL。

圖4 純化重組β2MG 蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of purified β2MG protein

2.5 兩種重組β2MG 蛋白的活性比較 間接ELISA法檢測結(jié)果顯示，隨著檢測抗體濃度的升高，抗原抗體反應(yīng)性整體呈上升趨勢。與市售對標β2MG 相比，在相同檢測抗體濃度下，自制重組蛋白His-β2MG與檢測用羊源β2MG 多克隆抗體的免疫學(xué)反應(yīng)性能略差，而自制重組蛋白Trx-His-β2MG 與檢測抗體的免疫學(xué)反應(yīng)性優(yōu)于對標β2MG。見圖5。表明不同表達載體對β2MG 的活性影響較明顯。

圖5 ELISA 法檢測兩種重組β2MG 蛋白的活性Fig.5 ELISA of activities of two recombinant β2MG proteins

3 討 論

本研究應(yīng)用基因重組技術(shù)將β2MG基因與不同載體連接，構(gòu)建重組表達菌株，成功表達了Hisβ2MG 和 Trx-His-β2MG 兩種重組蛋白，其中 Trx-Hisβ2MG 降低誘導(dǎo)溫度可實現(xiàn)完全可溶性表達，表明低溫誘導(dǎo)對獲得可溶性表達具有促進作用，這可能是由于降低溫度可放慢細胞內(nèi)蛋白表達速率，分子聚集通常是由于高溫下蛋白表達太快來不及正確折疊而形成，可見低溫誘導(dǎo)是減小細胞內(nèi)重組蛋白聚集的一個好方法［10］。通過分析兩種蛋白在E.coliBL21（DE3）中的不同表達形式發(fā)現(xiàn)，β2MG 在相同的宿主細胞中表達形式不同與表達載體相關(guān)，這可能是由于不同表達載體中所含的N-端標簽不同造成的，pET-32a（+）載體在 N-端含有增溶標簽 Trx，該標簽?zāi)艽龠M二硫鍵正確配對，幫助蛋白進行正確折疊［11］，有資料顯示，Trx 作為增溶標簽有利于蛋白的可溶性表達［12-13］。包涵體通常是由于蛋白瞬間表達量較高、蛋白錯誤折疊以及二硫鍵不能正確配對所導(dǎo)致，對于包涵體的一般處理方法是先變性，再通過合適的復(fù)性液進行透析復(fù)性，過程繁瑣，且得到的蛋白活性不一定完整，因此，蛋白的包涵體表達在一定程度上限制了其生物學(xué)活性［14-16］，這也合理解釋了Trx-Hisβ2MG 的免疫學(xué)活性明顯高于His-β2MG。

綜上所述，本研究利用兩種原核表達載體表達了重組人β2MG，表達的兩種融合蛋白活性相差明顯，且 Trx-His-β2MG 優(yōu)于對標 β2MG，不同載體對β2MG 的活性影響較大，表明選擇合適的表達載體是β2MG基因在大腸埃希菌中有效表達的一個重要影響因素［17］。本研究為進一步開展相關(guān)體外診斷試劑的研發(fā)及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。