胡澤斌，高飛，劉湘，蘭更欣，李麗莉，黃杰

1.中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所非傳染病診斷試劑室，北京100050 2.北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司，北京101111

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因位于6 號染色體短臂上6p21.3，全長約3 600 bp，由200 多個基因座位組成，是迄今已知基因中等位基因多態(tài)性最高的基因復(fù)合體［1-2］。HLA 在抗原識別、提呈、免疫應(yīng)答及調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，是導(dǎo)致移植排斥的主要抗原，也被稱為移植抗原［3］，因此，造血干細(xì)胞及器官移植均需在移植前進(jìn)行HLA 配型［4］。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基于DNA 序列的分型方法基本取代了傳統(tǒng)的血清學(xué)及細(xì)胞學(xué)分型方法［5-6］，主要包括低中分辨序列特異性引物方法（PCR sequence specific primer，PCR-SSP）、中分辨序列特異性寡核苷酸探針方法（polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probes，PCR-SSO）、高分辨基因測序分型方法（sequence-based typing，PCR-SBT）及近年迅速發(fā)展的二代高通量測序方法（next generation sequencing，NGS）［7-8］，其中 PCR-SBT 法是 WHO 推薦的HLA 分型方法的金標(biāo)準(zhǔn)。目前，已有多家企業(yè)的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1 基因分型檢測試劑盒獲批上市，同時還有許多企業(yè)正在申報此類試劑盒注冊。我國目前尚無針對HLA 組織配型基因分型檢測相關(guān)試劑盒的國家參考品，無法對該類試劑盒進(jìn)行統(tǒng)一的質(zhì)量評估，為確保其臨床測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，本實驗研制一套涵蓋中國人群常見HLA 位點型別信息的HLA 組織配型基因分型國家參考品，以期為臨床細(xì)胞組織器官移植配型提供保障。

1 材料與方法

1.1 樣本 采集45 名志愿者（均已簽署知情同意書）5 ～ 10 mL 外周血，置無菌肝素鋰抗凝采血管中，2 ～ 8 ℃保存。志愿者外周血基因組DNA 的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1 等 5 個位點的高分辨基因分型信息預(yù)先采用金標(biāo)準(zhǔn)PCR-SBT 法獲得。

1.2 病毒 EB 病毒液由深圳華大智造科技有限公司提供。

1.3 主要試劑及儀器 人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；基因組DNA 提取試劑盒（磁珠法）及Qubit Fluorometer 3.0 購自深圳華大智造科技有限公司；HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLADRB1、HLA-DQB1 位點基因高分辨分型試劑盒（測序法）購自北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司；Nano-Dorp 分光光度計購自美國安捷倫公司。

1.4 永生化淋巴細(xì)胞系的建立 45 份外周血樣本中加入人淋巴細(xì)胞分離液，300×g離心30 min，獲得單個核淋巴細(xì)胞；加入1.5 mL EB 病毒液，按文獻(xiàn)［9-10］的方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化及細(xì)胞培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞由單個逐漸成團(tuán)狀聚集，生長旺盛，則表明永生化細(xì)胞系建立成功。

1.5 國家參考品的制備及驗證 采用基因組DNA提取試劑盒（磁珠法）提取建立成功的永生化細(xì)胞系的基因組DNA，通過分光光度計測定A260／280。將基因組DNA 反復(fù)凍融3 次，取凍融前及凍融后的基因組DNA 樣本，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。通過 Qubit Fluorometer 3.0 精確定量各樣本的DNA 濃度，將各樣本稀釋至 20 ng ／ μL，經(jīng) HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1 位點基因高分辨分型試劑盒（測序法）對凍融前樣品進(jìn)行全外顯子基因分型，并與預(yù)先采用金標(biāo)準(zhǔn)SBT 法獲得的高分辨基因分型信息進(jìn)行比較。將檢測結(jié)果符合要求的樣本組成一套國家參考品。

1.6 國家參考品的穩(wěn)定性及均勻性驗證 隨機(jī)取3 套參考品在-20 ℃與室溫（20 ～ 25 ℃）之間反復(fù)凍融3 次（每隔1 d 凍融1 次），將凍融前后的基因組DNA 樣本按 1.4 項方法進(jìn)行A260／280測定、DNA 定量和瓊脂糖凝膠電泳分析，并采用PCR-SBT 法進(jìn)行分型驗證。

2 結(jié) 果

2.1 永生化淋巴細(xì)胞系的建立 45 份外周血樣本分離的單個核淋巴細(xì)胞經(jīng)EB 病毒轉(zhuǎn)化后，培養(yǎng)5 ～7 d，鏡下可見少量聚集的細(xì)胞團(tuán)；培養(yǎng)10 ～14 d 可見細(xì)胞團(tuán)變大變多，細(xì)胞生長旺盛，表明細(xì)胞已成功轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞樣B 細(xì)胞。見圖1。最終獲得38株永生化HLA 細(xì)胞系，編號為1 ～38。

圖1 細(xì)胞生長情況的鏡下觀察（× 100）Fig.1 Microscopy of cell growth（× 100）

2.2 國家參考品的制備及驗證 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，凍融前和凍融3 次后的DNA 樣品均未見拖帶或彌散帶，條帶完整清晰，符合實驗室對基因組DNA 完整性的要求，見圖2。DNA 樣品的A260／280均在1.80 ～2.15 之間，表明DNA 的純度較高，滿足檢測要求，且每份樣本2 條染色體的分型結(jié)果均與建系前外周血基因組DNA 的分型信息一致，見表1。將 38 份樣本按 30 μL 進(jìn)行分裝，濃度為 20 ng ／ μL，組成一套HLA-組織配型國家參考品盤。

圖2 凍融前后DNA 樣本的完整性檢測Fig.2 Integrity of DNA samples before and after freeze-thawing

表1 基因組DNA 樣本的純度及分型結(jié)果Tab.1 Purity and typing of genomic DNA samples

2.3 國家參考品的穩(wěn)定性及均勻性驗證 3 套國家參考品的A260／280在 1.80 ～ 2.15 之間，表明 DNA 純度不受影響；DNA 濃度為（20.0 ± 0.5）ng ／ μL，表明DNA 穩(wěn)定未降解；經(jīng)SBT 法驗證，3 套國家參考品凍融前后樣本的 HLA-A、B、C、DRB1、DQB1 基因的高分辨分型結(jié)果一致，且與2.2 項分型結(jié)果相符。表明本實驗室研制的HLA 組織配型基因分型國家參考品穩(wěn)定性和均勻性良好。

3 討 論

HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1 基因與組織器官移植密切相關(guān)，移植的供受體雙方HLA配型程度越高，移植成功率和受體長期存活率越高［11-12］，因此HLA 基因分型試劑盒的質(zhì)量關(guān)乎臨床檢測的準(zhǔn)確性，直接影響移植配型成功率和受體存活率，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是確保和提升試劑質(zhì)量的重要手段之一［13-14］。

足量原料的持續(xù)供應(yīng)是制約標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)展的瓶頸之一，尤其是大量多人份的臨床血液樣本。本研究采用永生化建系的手段解決該困難，充分確保了國家參考品的持續(xù)供應(yīng)及換批連續(xù)性。永生化建系僅需抽取志愿者外周血3 ～5 mL，操作簡便，永生化建立也是HLA 國際質(zhì)控盤通常采用的技術(shù)手段。因此，HLA 組織配型基因分型國家參考品與國際質(zhì)控盤（UCLA，IHWG）技術(shù)水平相當(dāng)，本研究建立的HLA基因中國人群實物參考盤為國際間的交流合作提供了支撐。本研究結(jié)果表明，永生化淋巴細(xì)胞系基因組HLA 的檢測結(jié)果與臨床血液樣本DNA 的HLA 分型結(jié)果一致，該永生化淋巴細(xì)胞系的遺傳信息穩(wěn)定，可作為國家參考品的遺傳資源。

HLA 組織配型基因分型參考品為首批研制的定性基因分型參考品，參考品原料系人全血轉(zhuǎn)化的永生化細(xì)胞系，參考品性質(zhì)為DNA 樣本，DNA 樣本自身的均勻性和穩(wěn)定性良好［15-16］，常規(guī)在-20 ℃以下保存，且要求干冰或-20 ℃冷鏈運(yùn)輸，用戶不宜反復(fù)凍融后使用。本研究將38 份DNA 樣本反復(fù)凍融3 次后，DNA 樣品的A260／280在 1.80 ～ 2.15 之間，分型結(jié)果均與PCR-SBT 法檢測結(jié)果一致，表明建立HLA組織配型基因分型國家參考品的量值準(zhǔn)確性、均一性和穩(wěn)定性均符合要求，可用于HLA 組織配型類核酸檢測試劑盒的質(zhì)量控制和評價。