曾潔媛，殷瓊洲，王雷，李家洪，張瑩，王麗春，李琦涵，杭連菊，車艷春

1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南昆明650118；2.湖北省疾病預防控制中心，湖北武漢430079；3.湖北省襄州區(qū)疾病預防控制中心，湖北襄州441199；4.湖北省襄陽市疾病預防控制中心，湖北襄陽441022

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）是由腸道病毒引起的多發(fā)于學齡前兒童的急性傳染?。?］。其中腸道病毒 71 型（entervirus type 71，EV71）是引起HFMD 的主要病原體之一，更是HFMD 重癥及死亡病例的首要致病原［2-3］。近年來，柯薩奇病毒A 組 6 型（Coxsackievirus A6，CVA6）曾在美國［4］、西班牙［5］、法國［6］等國家引起 HFMD 暴發(fā)；在我國大陸地區(qū)，該病毒自2012 年起亦引發(fā)多次HFMD 流行［7-12］，與其相關的HFMD 比例也逐漸上升，引起我國大陸地區(qū)HFMD 病原譜發(fā)生改變［12］。因此，由CVA6 導致的 HFMD 引發(fā)了學術界廣泛關注［13-14］。

腸道病毒傳染性強，主要通過消化道、呼吸道和密切接觸等途徑傳播，在短時間內可造成較大范圍的流行。由于目前國內大陸地區(qū)上市的EV71滅活疫苗對其他腸道病毒引起的HFMD 無交叉保護作用，為全面防控HFMD 疫情，除對適齡兒童接種EV71 滅活疫苗以預防EV71 相關HFMD 外，需同時關注腸道病毒傳染源，尤其應重點監(jiān)測非EV71的腸道病毒傳染源。人作為腸道病毒的唯一宿主，HFMD 患者和隱性感染者均為疾病傳播的主要傳染源，其中隱性感染者因其表現(xiàn)隱匿難以監(jiān)控，且易引起疫情的擴散和蔓延，為HFMD 防控帶來挑戰(zhàn)［15］。

為了解人群中EV71 及CVA6 的隱性感染情況，以及接種EV71 滅活疫苗后抗EV71 和抗CVA6中和抗體水平的變化，本研究在湖北省襄陽市招募無HFMD 疾病史及EV71 滅活疫苗接種史的6 ~ 71月齡兒童，在開展EV71 滅活疫苗上市后免疫原性研究的同時，平行觀察了CVA6 對健康兒童的感染情況，及其與EV71 滅活疫苗免疫效果的關系，以期為HFMD 防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 根據(jù)EV71 滅活疫苗上市后Ⅳ期臨床試驗的總體規(guī)劃，經湖北省疾病預防控制中心倫理委員會批準，在湖北省襄陽市開展了EV71 滅活疫苗上市后研究。研究入組人員為無HFMD 疾病史且無EV71 滅活疫苗接種史的6 ~ 71 月齡健康兒童，均由家長簽署知情同意書。

1.2 疫苗及細胞 EV71 滅活疫苗由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所生產，為微乳白色混懸液，每瓶0.5 mL，每次人用劑量為0.5 mL，中和抗體效價不低于3.0 EU，1 次免疫動物后誘導產生的中和抗體效價不低于3.0 EU；接種部位為兒童上臂三角肌，肌內注射（注射前須搖勻）；免疫2 劑次，每劑間隔1 個月。Vero 細胞和 RD 細胞由該所提供。

1.3 疫苗接種及樣本采集 由專業(yè)采血護士分別于疫苗接種第0 天（免疫前）和第2 劑接種后第28天采集2.5 mL 靜脈血于非抗凝管中，分離血清，置-20 ℃冰箱凍存待檢。共采集115 名研究對象的免疫前及免疫后血樣。

1.4 抗EV71 中和抗體檢測 采用微量中和試驗。將待檢血清用MEM 基礎培養(yǎng)液以1 ∶2 比例稀釋后置56 ℃水浴鍋中滅活30 min；用MEM 基礎培養(yǎng)液將EV71 收獲液（由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供）稀釋至使用濃度為100 CCID50／ 0.05 mL，作為病毒攻擊液。于96 孔板中加入MEM 基礎培養(yǎng)液，50 μL ／ 孔，將每份血清樣品按編號加入板中第1行，50 μL ／ 孔，每板 2 孔，然后對板中血清樣品進行2 倍系列稀釋至所需稀釋度（即從第1 列以1 ∶4的比例開始進行2 倍系列稀釋），最后1 孔混勻后棄去50 μL 混合液，病毒對照、細胞對照不加血清；向板中各孔加入 EV71 攻擊液，50 μL ／ 孔，細胞對照不加病毒攻擊液，將病毒攻擊液從100 CCID50／0.05 mL開始10、100、1 000 倍稀釋后，分別加入病毒回滴板中，每個稀釋度 4 孔，50 μL ／ 孔，每孔補加 MEM 基礎培養(yǎng)液50 μL（相當于血清量），37 ℃孵箱中和3 h；胰酶消化對數(shù)生長期的Vero 細胞，用含10%滅活FBS 的細胞生長液制備濃度為106個 ／ mL 的細胞懸液，各孔均加入細胞懸液100 μL，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d；每日觀察細胞病變效應（CPE）。抗EV71 中和抗體滴度 ≥ 1 ∶8 記為陽性。

1.5 抗CVA6 中和抗體檢測 采用微量中和試驗。將待檢血清用MEM 基礎培養(yǎng)液以1 ∶2 比例稀釋后置56 ℃水浴鍋中滅活30 min；用MEM 基礎培養(yǎng)液將CVA6 收獲液（由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所提供）稀釋至使用濃度為100 CCID50／50 μL。于96 孔板中加入 MEM 基礎培養(yǎng)液，50 μL ／ 孔，將每份血清樣品按編號加入板中第 1 行，25 μL ／ 孔，每板 2孔，然后對板中血清樣品進行2 倍系列稀釋至所需稀釋度（即從第1 列以1 ∶4 的比例開始進行2 倍系列稀釋），最后1 孔混勻后棄去50 μL 混合液，病毒對照、細胞對照不加血清。向板中各孔加入CVA6 病毒液，50 μL ／ 孔，細胞對照不加病毒液，將病毒液從100 CCID50／ 0.05 mL 開始 10、100、1 000 倍稀釋后，分別加入病毒回滴板中，每個稀釋度4 孔，50 μL／孔，每孔補加MEM 基礎培養(yǎng)液50 μL（相當于血清量），37 ℃孵箱中和3 h；胰酶消化對數(shù)生長期的RD 細胞，用含10%滅活FBS 的細胞生長液制備濃度為106個 ／mL 的細胞懸液，各孔均加入細胞懸液100 μL，置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，每日觀察CPE?？笴VA6 中和抗體滴度≥1 ∶4 記為陽性。

1.6 統(tǒng)計學分析 非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)描述集中趨勢，以四分位數(shù)間距描述其離散趨勢；以GMT 描述抗體水平；計數(shù)資料采用頻數(shù)和構成比（%）描述分布情況。采用Kruskal-Wallis秩和檢驗比較研究對象免疫前及免疫后抗體滴度差異；計數(shù)資料采用χ2檢驗比較組間差異；以Cochran-Armitage趨勢檢驗進行趨勢分析。統(tǒng)計學檢驗均為雙側檢驗，α 取0.05。運用Stata 14.0 軟件進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 研究對象概況 共采集了115 名無HFMD 疾病史和EV71 疫苗接種史適齡兒童的免疫前及免疫后血樣。研究對象月齡中位數(shù)為31（四位分數(shù)間距：14 ~ 66），最小月齡為6，最大月齡為71。男童64名，占比55.65%，女童51 名，占比44.35%。不同年齡組的人數(shù)及性別構成情況見表1，各組性別分布差異無統(tǒng)計學意義（P= 0.267）。

表1 不同年齡組健康兒童性別構成情況Tab.1 Gender composition of healthy children in various age groups

2.2 EV71 滅活疫苗適齡接種人群的免疫前抗EV71及抗CVA6 中和抗體水平 該地區(qū)無HFMD 疾病史和EV71 疫苗接種史的適齡接種兒童的免疫前抗EV71 及抗CVA6 中和抗體陽性率分別為27.93%和33.91%。4 個年齡組的抗EV71 抗體陽性率為0.00% ~ 51.11%，抗CVA6 中和抗體陽性率為21.74% ~ 47.83%，均呈現(xiàn)隨月齡增加而逐漸升高的趨勢（EV71：P< 0.001，CVA6：P= 0.037）。見表2。

表2 EV71 滅活疫苗適齡接種兒童免疫前抗EV71 及抗CVA6 中和抗體陽性率Tab.2 Positive rates of neutralizing antibody against EV71 and CVA6 in serum samples of children before inoculation with inactivated EV71 vaccine

2.3 EV71 滅活疫苗適齡接種兒童的中和抗體共同陽性率 該地區(qū)無HFMD 疾病史和EV71 疫苗接種史的6 ~ 71 月齡兒童的抗EV71 及抗CVA6 中和抗體共同陽性率為15.32%。完成EV71 滅活疫苗2劑免疫后，共同陽性率升至32.74%。見表3。4 個年齡組兒童抗體共同陽性率在完成EV71 滅活疫苗2 劑免疫后均上調，最高為 ＞35 ~ 71 月齡組的50.00%，見圖 1。

表3 EV71 滅活疫苗適齡接種兒童免疫前及免疫后抗EV71 及抗CVA6 中和抗體共同陽性率Tab.3 Co-positive rates of neutralizing antibodies against EV71 and CVA6 in serum samples of children before and after inoculation with inactivated EV71 vaccine

圖1 不同年齡組EV71 滅活疫苗接種人群的免疫前及免疫后抗EV71 及抗CVA6 中和抗體陽性率Fig.1 Positive rates of neutralizing antibodies against EV71 and CVA6 in serum samples of children before and after inoculation with inactivated EV71 vaccine in various age groups

2.4 EV71 滅活疫苗適齡接種兒童全程免疫后的抗體水平變化 該地區(qū)適齡兒童完成EV71 滅活疫苗2 劑免疫后，抗EV71 中和抗體陽性率和GMT 分別由免疫前27.93%和7.01 升至98.23%和46.52（P均< 0.001）；而抗CVA6 中和抗體陽性率仍維持在 33.91%，GMT 由3.09 升至 4.10，但差異無統(tǒng)計學意義（P= 0.348），見表 4 和表 5。

表4 EV71 滅活疫苗接種人群的抗EV71 及抗CVA6 中和抗體陽性率Tab.4 Positive rates of neutralizing antibody against EV71 and CVA6 in serum samples of children before and after inoculation with inactivated EV71 vaccine

表5 EV71 滅活疫苗接種人群的抗EV71 及抗CVA6 中和抗體GMTTab.5 GMTs of neutralizing antibodies against EV71 and CVA6 in serum samples of children inoculated with inactivated EV71 vaccine

接種2 劑EV71 滅活疫苗后，4 個年齡組的抗EV71 中和抗體陽性率均明顯上升（P均 < 0.001），除 ＞23 ~ 35 月齡組為91.30%外，其他3 組陽性率均達到100.00%；而4 組抗CVA6 中和抗體陽性率在免疫前及免疫后均維持不變。見圖2。4 個年齡組免疫后抗EV71 中和抗體GMT 均較免疫前上升（P均 < 0.001），但抗CVA6 中和抗體GMT 與免疫前相比差異均無統(tǒng)計學意義（P均 > 0.05）。見圖3。

圖2 不同年齡組EV71 滅活疫苗接種人群免疫前及免疫后的抗EV71 及抗CVA6 中和抗體陽性率Fig.2 Positive rates of neutralizing antibodies against EV71 and CVA6 in serum samples of children in various age groups before and after inoculation with inactivated EV71 vaccine

圖3 不同年齡組EV71 滅活疫苗接種人群免疫前及免疫后的抗EV71 及抗CVA6 中和抗體GMTFig.3 GMTs of neutralizing antibodies against EV71 and CVA6 in children of various age groups before and after inoculation with inactivated EV71 vaccine

3 討 論

隱性感染者是HFMD 傳播的主要傳染源之一，因其表現(xiàn)隱匿難以監(jiān)控，且易引起疫情擴散及蔓延，為防控HFMD 帶來挑戰(zhàn)［15］。當前我國大陸地區(qū)的腸道病毒血清流行病學研究多以HFMD 患者為研究對象，著重探索HFMD 的病原譜，對健康人群的腸道病毒中和抗體水平及隱性感染狀況研究相對較少［16-18］。因HFMD 的主要致病病原體為EV71 和CVA16，2 種病毒的流行率均在80%以上，因此當前針對健康人群的腸道病毒抗體水平的研究也主要關注EV71 和CVA16［16-17］，少有研究調查健康人群的CVA6 抗體水平和隱性感染狀況。目前可查詢到的CVA6 隱性感染現(xiàn)狀的報道是王宏宇［18］于2010年在山東省濟寧市開展的一項HFMD 病例對照研究，結果顯示，該地區(qū)254名3 ~ 60 月齡健康兒童的EV71 和CVA6 中和抗體陽性率分別為15.0%和1.6%。本研究對襄陽市無HFMD 疾病史和EV71 滅活疫苗接種史的6 ~ 71 月齡兒童的調查顯示，該人群免疫前血清抗EV71 及抗CVA6 中和抗體陽性率分別為27.93%和33.91%，與陳潤莉等［16］報道的健康人群中25.50%的抗EV71 中和抗體陽性率一致，高于王宏宇［18］報道的15.0%。該人群抗CVA6中和抗體陽性率高達33.91%，也與2012 年以來我國大陸地區(qū)CVA6 相關HFMD 比例上升的報道相符［7-12］。此外，兩種抗體陽性率隨年齡增加總體呈上升趨勢，與郭學斌等［19］及孫寶昌等［20］的研究結果一致，可能是隨著年齡增長，兒童機體免疫力增強，經外界感染不同型別腸道病毒的機會增加，因此通過隱性感染獲得特異性免疫力的比例也隨之上升。然而也有其他研究結果認為二者呈相反關系［21-22］。本研究還發(fā)現(xiàn)，該人群共同感染上述2 種病毒的隱性感染率達15.32%，提示當前腸道病毒隱性感染情況復雜，需重點監(jiān)控。

在完成2 劑EV71 滅活疫苗免疫后，無論是總體情況還是各年齡組，適齡健康兒童的抗EV71 中和抗體陽性率和GMT 均較免疫前明顯上升；但抗CVA6中和抗體陽性率在免疫后仍維持不變，GMT 在免疫前后差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果顯示，接種EV71 滅活疫苗并不影響接種兒童的抗CVA6 中和抗體水平，表明EV71 和CVA6 之間無交叉反應。當前我國大陸地區(qū)上市的EV71 滅活疫苗的疫苗株來源為EV71 的C4 亞型C4a 分支，既往多項研究也指出，該亞型EV71 僅針對EV71 的其他基因型或亞型，如 B1、B3、B4、B5、C1、C2、C3、C4 及 C5 起交叉保護作用［23-25］，且上市前臨床研究也未發(fā)現(xiàn)該疫苗對CVA16 及其他腸道病毒相關HFMD 起到交叉保護作用［26-27］。我國在 2012 年后 HFMD 病原譜的改變，以及當前適齡接種兒童較高的EV71 和CVA6 隱性感染率，均對當前HFMD 的防控提出了新挑戰(zhàn)。

本研究初步調查了無HFMD 疾病史和EV71 滅活疫苗接種史的適齡接種兒童的血清抗EV71 及CVA6 中和抗體陽性率，以了解該人群EV71 及CVA16隱性感染率，為HFMD 防控提供科學依據(jù)。研究同時分析了適齡接種兒童完成EV71 滅活疫苗全程免疫后抗CVA6 中和抗體水平的變化，為探索接種EV71 滅活疫苗后CVA6 與EV71 的交叉反應情況提供參考。由于當前研究對象來自特定區(qū)域，樣本量有限，不能代表我國大部分地區(qū)EV71 及CVA16的隱性感染總體情況。因此，更為明確的結果有待更多地域、更大人群范圍的數(shù)據(jù)來進一步驗證。