王春梅 劉晉佳 姜玉鎖*

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801）

2型糖尿?。═ype 2 diabetes，T2DM）是一種以高血糖和胰島素抵抗為特征的異質(zhì)性代謝紊亂的慢性疾病。據(jù)最新國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布的全球糖尿病地圖（第9 版）顯示，全球糖尿病患病人數(shù)不斷上升。目前全球約有4.63 億20～79 歲成人患糖尿病，預(yù)計到2045 年，糖尿病患者會達到7.002 億。而中國糖尿病患者約有1.164 億人，位居世界第一。T2DM 的發(fā)生與發(fā)展與許多因素有關(guān)，其中糖或脂質(zhì)攝入過多以及遺傳因素極大可能地促進T2DM 的發(fā)生。炎癥、血糖和血脂異常是T2DM患者心血管疾病的已知危險因素。

盡管二甲雙胍是目前國際上公認的臨床首選降糖藥物，但服用后會出現(xiàn)食欲減退、惡心嘔吐、大便稀薄與腹瀉等一些毒副作用。因此，有必要尋找一種安全、有效的替代劑，例如飲食成分作為輔助治療，更好地預(yù)防T2DM 發(fā)生及緩解其病程發(fā)展。蜂王漿（Royal jelly）是適齡工蜂咽下腺（Subpharyngeal gland）和上顎腺（Mandibular gland）分泌出來的乳漿狀物質(zhì)，呈淡黃色或乳白色。蜂王漿含有豐富的氨基酸、維生素、微量元素、活性酶等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種理想的天然調(diào)節(jié)劑和營養(yǎng)滋補劑，現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用于人體保健、疾病治療等多方面?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蜂王漿具有抗氧化、抗病毒、抗炎、促進傷口愈合和調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等作用，其主要功效成分10-羥基-2-癸烯酸（10-H2DA）是迄今為止發(fā)現(xiàn)僅在蜂王漿中天然存在且含量最高的有機酸，被稱為王漿酸。早期生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蜂王漿中具有類胰島素活性物質(zhì)，并通過臨床試驗證明該物質(zhì)可調(diào)節(jié)健康人體的葡萄糖代謝。Chen 等通過RAW264.7 炎癥細胞模型，發(fā)現(xiàn)蜂王漿中存在3 種主要脂肪酸：反式-10-羥基-2-癸烯酸（10-H2DA）、10-羥基癸烯酸（10-HDAA）和癸二酸（SEA），這3 種脂肪酸對主要炎癥介質(zhì)一氧化氮和白細胞介素-10 的釋放具有有效的劑量依賴性抑制作用。此外，Khoshpey 等通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)蜂王漿能改善載脂蛋白A-1 及載脂蛋白B 和載脂蛋白A-1 的比率，從而降低糖尿病患者患心血管病的幾率。這為進一步探討蜂王漿凍干粉對T2DM 的降糖、調(diào)節(jié)血脂及抗炎癥作用提供了理論依據(jù)。本試驗以高脂飲食聯(lián)合低劑量STZ 誘導(dǎo)的T2DM小鼠為模型，研究蜂王漿凍干粉對T2DM的治療作用，為蜂王漿的進一步開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與藥物

蜂王漿凍干粉，10-HDA≥4.0%，神蜂科技開發(fā)有限公司（注：蜂王漿凍干粉的成人推薦治療劑量為12 g/d～15 g/d，相當(dāng)于200 mg/kg·bw～250 mg/kg·bw，因此，本試驗選取80 mg/kg·bw、240 mg/kg·bw、400 mg/kg·bw3 個劑量對T2DM 小鼠進行干預(yù)）；鏈脲佐菌素（STZ），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甘油三脂（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）檢測試劑盒，北京中生北控股份有限公司；空腹胰島素（FINS）、腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介細胞素-6（IL-6）檢測試劑盒，北京華英生物技術(shù)有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC），北京索萊寶科技有限公司；Co60 輻照維持飼料，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司；高脂飼料，D12492，美國Research Diets 公司；檸檬酸鈉緩沖液，pH=4.5，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

TW423L 電子天平，日本島津國際貿(mào)易有限公司；5427R 高速冷凍離心機，艾本德中國有限公司；BS-420 邁瑞全自動生化儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；DR-200BS 華衛(wèi)德朗酶標(biāo)分析儀，無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司；GA-3 血糖儀及配套試紙，三諾生物傳感股份有限公司；其余設(shè)備均為實驗室常用儀器。

1.2 方法

1.2.1 T2DM模型建立及分組給藥

SPF 級雄性BALB/c 小鼠，4～6 周齡，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。所有小鼠均嚴格遵循國際動物實驗規(guī)則和國際公認的實驗室動物使用和護理倫理原則。小鼠飼養(yǎng)在設(shè)施通風(fēng)良好，環(huán)境溫度為（24±2）℃，相對濕度為50%～60%的動物室內(nèi)，按12 h 光照/黑暗周期飼養(yǎng)，并進行自由采食與飲水。Co60 輻照維持飼料由4%脂肪，55%碳水化合物、18%蛋白質(zhì)組成，高脂飼料（D12492）由24.9%脂肪，26.3%碳水化合物、26.2%蛋白質(zhì)組成。

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，按體重隨機選取10 只小鼠作為普通維持飼料飼喂的正常組（CON），其余小鼠則以高脂飲食（High-fat diet，HFD）D12492進行飼喂。飼喂4 周后，禁食過夜，高脂飲食的小鼠連續(xù)5 d 低劑量腹腔注射STZ（40 mg/kg·bw，溶于0.1 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液）；CON 組小鼠注射等容量檸檬酸鈉緩沖溶液。一周后，禁食過夜，用血糖儀測量小鼠尾靜脈的空腹血糖水平，其中模型小鼠空腹血糖值高于11.1 mmol/L 的為T2DM小鼠。選取40 只體重和血糖程度相似的T2DM 小鼠隨機分為4 組：蜂王漿凍干粉低劑量組（RJP-L，80 mg/kg·bw）、蜂王漿凍干粉中劑量組（RJP-M，240 mg/kg·bw）、蜂王漿凍干粉高劑量組（RJP-H，400 mg/kg·bw）和模型組（T2DM）。T2DM 組與CON 組小鼠以等容量羧甲基纖維素鈉（CMC）進行灌胃，每日灌胃給藥一次，連續(xù)4 周。給藥期間所有小鼠均飼喂Co60 輻照維持飼料。觀察并記錄各組小鼠生長情況。

1.2.2 血糖水平測定

分別于第0 d、7 d、14 d、21 d、28 d 給藥后，禁食過夜，通過剪尾取血，用血糖儀測定小鼠空腹血糖值（FBG）。

1.2.3 口服葡萄糖耐糖試驗（OGTT）

各組小鼠在干預(yù)28 d 后，禁食過夜，進行OGTT。給所有小鼠口服葡萄糖溶液（2 g/kg），隨后使用血糖儀分別在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min 從尾尖取血進行血糖水平測定。

1.2.4 血液生化指標(biāo)測定

OGTT 完成后，從小鼠眼眶后靜脈叢采血并分離血清，使用邁瑞B(yǎng)S-420 全自動生化儀測定血清中TG、TC、LDL-C 和HDL-C 水平。同時使用華衛(wèi)德朗DR-200BS 酶標(biāo)分析儀通過酶免法分析血清中TNF-α、IL-6、FINS 水平。根據(jù)公式：空腹血糖（mmol/L）×空腹胰島素（μU/mL）/22.5，進行胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型評估（HOMA-IR）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和LSD 多重比較。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，P＜0.05 表示有顯著差異，P＜0.01 表示有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 RJP 對T2DM 小鼠血糖及耐糖量的影響

RJP 對T2DM 小鼠空腹血糖及耐糖量的影響結(jié)果見表1。

如表1 所示，在整個試驗期間，與CON 組小鼠相比，T2DM 組一直處于較高FBG 水平（P＜0.01），且血糖水平穩(wěn)定。T2DM 組與3 個RJP 干預(yù)組的初始FBG 水平相似（P＞0.05），均顯著高于CON 組（P＜0.01）；與T2DM 組相比，在干預(yù)的第28 d，RJP-L 組可顯著降低FBG 水平（P＜0.05），在干預(yù)的第21 d 和28 d，RJP-M 組可顯著降低FBG 水平（P＜0.05，P＜0.05），在干預(yù)的第14 d、21 d 和28 d，RJP-H 組顯著降低了FBG 水平（P＜0.05）。試驗結(jié)果表明，RJP 具有顯著的降血糖作用。

表1 RJP 對T2DM 小鼠空腹血糖水平的影響

RJP 對T2DM小鼠糖耐量的影響結(jié)果見下頁表2。

表2 RJP 對T2DM 小鼠糖耐量的影響

由表2 可知，在OGTT 中，T2DM 組在0 min、30 min、60 min、90 min 和120 min 的血糖水平均顯著高于CON 組（P＜0.01）。但與T2DM 組相比，RJP-M 分別在0 min、30 min、60 min 和90 min 顯著降低了血糖水平（P＜0.05，P＜0.01），RJP-H 組則分別在30 min 和60 min 顯著降低了血糖水平，而RJP-L 組在各個時間點血糖水平均低于T2DM組但差異不顯著（P＞0.05）。說明RJP 可顯著提高T2DM小鼠的葡萄糖耐受能力。

2.2 RJP 對T2DM 小鼠脂代謝的影響

RJP 對T2DM小鼠脂代謝的影響結(jié)果見表3。

表3 RJP 對T2DM 小鼠TC、TG、LDL-C 及HDL-C 的影響

由表3 可知，28 d 干預(yù)期結(jié)束后，與CON 組小鼠相比，T2DM組小鼠的血清TG 水平顯著升高，HDL-C 水平顯著下降（P＜0.01），TC、LDL-C 水平無顯著差異（P＞0.05）。經(jīng)RJP 給藥后，RJP-L組TG 水平顯著降低（P＜0.05），且3 個RJP 干預(yù)組都能顯著提高HDL-C 水平（P＜0.01），而對TC和LDL-C 水平無顯著影響（P＞0.05），說明RJP 對糖尿病所致的TG 和HDL-C 紊亂具有調(diào)節(jié)作用。

2.3 RJP 對T2DM 小鼠胰島素抵抗的影響

RJP 對T2DM小鼠胰島素抵抗的影響結(jié)果見表4。

由表4 可知，與CON 組相比，T2DM 組的FINS 和HOMA-IR 水平顯著升高（P＜0.01）。經(jīng)RJP 干預(yù)后，與T2DM組相比，RJP-M組與RJP-H組顯著降低了HOMA-IR 水平（P＜0.05），而各RJP 干預(yù)組的FINS 水平均下降，但無顯著性差異（P＞0.05），說明RJP 能增加胰島素的敏感性、降低胰島素抵抗。

表4 RJP 對T2DM 小鼠FINS 和HOMA-IR 的影響

2.4 RJP 對T2DM 小鼠炎癥因子的影響

RJP 對T2DM 小鼠炎癥因子的影響結(jié)果如表5所示。

表5 RJP 對T2DM 小鼠TNF-α 和IL-6 的影響

由表5 可知，與CON 組相比，T2DM組血清中IL-6、TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01），而3 個RJP 干預(yù)組均可顯著降低血清中IL-6、TNF-α 的水平（P＜0.01），說明RJP 能降低IL-6、TNF-α的水平，進而延緩T2DM病程發(fā)展。

3 討論

本試驗在高脂飲食的基礎(chǔ)上，通過多次低劑量STZ 誘導(dǎo)，得到具有T2DM 典型特征的小鼠模型，其糖脂代謝異常、葡萄糖耐受能力降低、高胰島素血癥以及胰島素敏感性降低，并且血清中炎癥因子TNF-α、IL-6 水平顯著升高。

T2DM 是一種以高血糖、胰島素缺乏和胰島素抵抗為特點的慢性疾病，嚴重影響著患者的生命健康及生活質(zhì)量。試驗中T2DM小鼠的血糖水平異常升高，并在試驗期結(jié)束時達到了最高值，經(jīng)RJP 干預(yù)結(jié)束后，3 個RJP 干預(yù)組血糖水平均顯著下降，且RJP-H 組效果最好，但仍未恢復(fù)到正常小鼠FBG 水平，這可能與干預(yù)周期太短有關(guān)。葡萄糖耐量降低意味著體內(nèi)糖代謝的某一個或數(shù)個環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，因此糖耐量是評價藥物藥效的一個重要手段。OGTT 試驗結(jié)果表明，T2DM 組的血糖值在各個時間點均顯著高于CON 組，說明其葡萄糖耐受能力大大降低，經(jīng)RJP 干預(yù)后，RJP-M 組與RJP-H 組能顯著提高葡萄糖的耐受能力。胰島素抵抗是T2DM 的主要特征，貫穿著病情發(fā)展的始終。試驗結(jié)果表明，與CON 組相比，T2DM組小鼠血清FINS 水平及HOMA-IR 顯著升高，說明該模型具有高胰島素及胰島素抵抗的特征，給予RJP 后RJP-M組及RJP-H 組顯著降低了HOMA-IR 水平這與文獻中報道的蜂王漿能降低血糖，改善胰島素抵抗的結(jié)果是相符的。

脂質(zhì)代謝紊亂是T2DM又一重要特征，而脂質(zhì)代謝異常又進一步加重糖代謝紊亂，二者互為因果關(guān)系。TC、TG、HDL-C、LDL-C 是反應(yīng)T2DM 血脂情況的關(guān)鍵指標(biāo)，其中TC、TG 異?；颊甙l(fā)生糖尿病、各類肝病及心血管動脈硬化的風(fēng)險較大。同時，已有研究表明，在T2DM 中，患者血液中HDL-C 降低或LDL-C 的升高，導(dǎo)致HDL-C 無法抑制LDL-C 與血管壁彈性成分結(jié)合及內(nèi)皮細胞對LDL-C 攝取，從而減弱了內(nèi)皮細胞的保護作用，最終引起血管粥樣硬化的發(fā)生。本試驗T2DM組中的TG、HDL-C 水平均低于CON 組，RJP 干預(yù)后RJP-L 組TG 水平有所下降，而各RJP 干預(yù)組的HDL-C 水平有所上升，可見RJP 在機體內(nèi)對脂代謝紊亂有良好的調(diào)節(jié)作用。

另外，TNF-α 和IL-6 等多種炎癥因子與胰島素抵抗、T2DM存在密切聯(lián)系。TNF-α 作為機體炎癥反應(yīng)過程中最早出現(xiàn)的炎癥因子，在糖蛋白的信號傳導(dǎo)與合成中扮演著重要角色，糖耐量異常患者TNF-α 水平明顯升高；IL-6 能夠抑制機體中胰島素受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并降低胰島素敏感性。當(dāng)TNF-α、IL-6 等炎癥因子及炎性細胞在局部血管內(nèi)皮中積累時，便可引起內(nèi)屏功能障礙，進而引發(fā)糖尿病并發(fā)癥。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食聯(lián)合STZ 誘導(dǎo)的T2DM 小鼠血清中炎癥因子IL-6、TNF-α 水平明顯升高，而使用RJP 干預(yù)后，小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平在各劑量干預(yù)組中明顯降低，提示RJP 干預(yù)能有效的抑制T2DM小鼠機體的炎癥反應(yīng)，這與Kunpyo 的研究結(jié)果相似。Kunpyo 等通過脂多糖刺激誘導(dǎo)的腹腔巨噬細胞炎癥模型發(fā)現(xiàn)，蜂王漿具有抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、NO 的產(chǎn)生和NF-κB 活性，具有抗炎作用。

4 結(jié)論

綜上所述，蜂王漿凍干粉不僅能顯著降低血糖、血脂，還能通過調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6 炎癥因子進一步改善胰島素抵抗，具有一定的臨床應(yīng)用價值并且有望成為輔助治療T2DM的功能食品。但本試驗只是對蜂王漿凍干粉進行了研究，尚不明確蜂王漿抗T2DM 作用的有效活性成分，故對蜂王漿抗T2DM 作用機制進行多靶點深層次研究，以及篩選出有效活性成分是日后研究重點。