趙 博 王利剛 張 婧 周正海 陳 欣 付莎莉 費云滟 吳 丹

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401123）

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）屬李斯特氏菌屬，是人類常見的食源性致病菌，該菌廣泛存在于自然界，很容易污染食品，其中肉制品、奶與奶制品、水產(chǎn)品、蔬菜等更容易受單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有較強的致病性，感染后可導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)等癥狀，公共健康危害極為嚴(yán)重，我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中對其限量進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定。能力驗證作為實驗室常用的質(zhì)量控制手段，可以確定實驗室某些項目的檢測能力，有助于提高實驗室檢驗水平、知名度和信任度。許多檢驗機構(gòu)會根據(jù)自身情況，定期參加相關(guān)機構(gòu)組織的能力驗證，以保持檢驗機構(gòu)的檢驗?zāi)芰?。為驗證本實驗室食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測能力保持情況，參加了2020 年中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評估中心組織的ACAS-PT903 食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測能力驗證，現(xiàn)將本次能力驗證的過程、結(jié)果以及其中采用的操作進(jìn)行總結(jié)分析，以期能夠更好地指導(dǎo)今后的檢驗工作。

1 材料與方法

1.1 參試樣品來源

食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測能力驗證樣品，由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評估中心提供，本次能力驗證計劃編號為ACAS-PT903（2020），共2 個樣品，樣品編號分別為20-Y466、20-Y863。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

李氏增菌肉湯（LB）、PALCAM 瓊脂、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、木糖發(fā)酵管、鼠李糖發(fā)酵管等相關(guān)配套試劑，產(chǎn)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；API Listeria 李斯特菌屬鑒定試劑盒、VITEK 2 compact革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡，產(chǎn)自法國生物梅里埃公司；BAX System PCR Assay L.monocytogenes 試劑盒，產(chǎn)自美國杜邦公司。

1.3 儀器設(shè)備

Climacell 恒溫培養(yǎng)箱，德國MMM 公司；VITEK 2 compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)，法國生物梅里埃公司；BAX system Q7 全自動病原微生物檢測系統(tǒng)，美國杜邦公司。

1.4 試驗方法

根據(jù)ACAS-PT903（2020）食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測能力驗證參試指導(dǎo)書要求對2 個樣品進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特氏菌定性檢驗，檢驗依據(jù)為《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30—2016第一法）。

1.4.1 增菌

樣品開啟后，立即加入5 mL 稀釋液進(jìn)行水化，待溶解后，吸出放入無菌袋中，再反復(fù)用余下的稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁，清洗液倒入上述無菌袋中，此溶液即為待測樣品原液。

以無菌操作取樣品25 mL 加入到含有225 mL LB1 增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1 min。于30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，移取0.1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL LB2 增菌液內(nèi)，于30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.4.2 BAX Q7 分子方法跟蹤檢測

取待測樣品原液1 mL 接種于含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE），30 ℃培養(yǎng)24 h 后，取培養(yǎng)物0.1 mL 接種于5 mL 營養(yǎng)肉湯，36 ℃培養(yǎng)18 h；分別取0.1 mL LB1和LB2增菌液的培養(yǎng)物接種于5 mL 營養(yǎng)肉湯，36 ℃培養(yǎng)18 h。

分別移取5 μL 以上培養(yǎng)物至盛有200 μL 裂解液的裂解管中，置于金屬浴孵育器中，孵育程序為55 ℃60 min，95 ℃10 min，4 ℃冷卻5 min。移取50 μL 裂解物于PCR 管，放入BAX System Q7 全自動病原微生物檢測系統(tǒng)，選擇單核細(xì)胞增生李斯特氏菌程序進(jìn)行檢測。

1.4.3 分離

取LB2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM 瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)48 h，觀察各個平板上生長的菌落。

1.4.4 初篩

從李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板上分別挑取3～5 個典型或可疑菌落，分別接種于木糖、鼠李糖發(fā)酵管，36 ℃培養(yǎng)24 h，同時在TSA-YE 平板上劃線，36 ℃培養(yǎng)18 h，選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。

1.4.5 鑒定

對1.4.4 中初篩可疑培養(yǎng)物分別進(jìn)行染色鏡檢，并采用API Listeria 李斯特菌屬鑒定試劑盒和VITEK 2 compact 革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 增菌與分子方法跟蹤檢測情況

經(jīng)培養(yǎng)，20-Y466、20-Y8632 個樣品的LB1、LB2培養(yǎng)物均渾濁，說明LB1、LB2培養(yǎng)基中均有微生物生長。BAX Q7 分子方法跟蹤檢測情況見下頁圖1。由圖1 可知，20-Y466、20-Y8632 個樣品的原液培養(yǎng)物、LB1和LB2增菌液的培養(yǎng)物均檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。

圖1 原液培養(yǎng)物、LB1 和LB2 增菌液的培養(yǎng)物BAX system Q7 檢測結(jié)果

2.2 選擇性分離與初篩情況

20-Y466、20-Y8632 個樣品的LB2 培養(yǎng)物劃線分離后，在李斯特氏菌顯色平板和PALCAM平板上均存在符合標(biāo)準(zhǔn)或培養(yǎng)基產(chǎn)品說明書描述的典型菌落，菌落形態(tài)見下頁表1。由表1 可知，20-Y466、20-Y8632 個樣品挑取的典型菌落木糖發(fā)酵結(jié)果均為陰性，鼠李糖發(fā)酵結(jié)果均為陽性，符合單核細(xì)胞增生李斯特氏菌生化特性。

表1 選擇分離生長與初篩發(fā)酵結(jié)果

2.3 鑒定結(jié)果

20-Y466、20-Y863 典型菌落的API Listeria 李斯特菌屬鑒定試劑盒鑒定結(jié)果見表2。根據(jù)產(chǎn)品使用說明書可判定20-Y466、20-Y863 典型菌落均為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。

表2 API Listeria 李斯特菌屬鑒定試劑盒鑒定結(jié)果

20-Y466、20-Y863 典型菌落使用VITEK 2 compact 革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡進(jìn)行鑒定，檢驗結(jié)果顯示典型菌落均為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，詳見表3。

表3 VITEK 2 compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果

2.4 篩檢與鑒定情況比較

將篩檢、分離、鑒定的結(jié)果匯總、比較，詳見表4?？梢钥闯?，20-Y466、20-Y8632 個樣品篩檢、分離、鑒定結(jié)果的指向一致，均顯示樣品中存在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。因此，判定20-Y466、20-Y8632 個樣品均檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。

表4 篩檢、分離、鑒定的結(jié)果匯總

3 討論

本次比對中，在按照標(biāo)準(zhǔn)步驟檢驗的同時采用BAX Q7 對樣品的原液培養(yǎng)物、LB1和LB2增菌液的培養(yǎng)物進(jìn)行篩檢，檢驗周期較短，幾小時即可獲得檢驗結(jié)果，本試驗采用跟蹤檢測的方式可以避免假陽性。在對原液進(jìn)行篩檢時，先使用含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）對其進(jìn)行培養(yǎng)，此目的在于對樣品中可能受損的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行復(fù)蘇、復(fù)壯以避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。另外，LB1、LB2培養(yǎng)基中含有鹽酸吖啶黃，如果直接使用LB1、LB2增菌液進(jìn)行BAX Q7 檢測，會影響其熒光信號的檢測，造成試驗無效。

李斯特氏菌顯色平板中的呈色物質(zhì)底物可與李斯特氏菌具有的酶發(fā)生特異性反應(yīng)，水解底物，釋放出顯色基團(tuán)。在平板上，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、綿羊李斯特氏菌呈現(xiàn)藍(lán)綠色菌落，但單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌的菌落周圍有一不透明的白色暈圈。在PALCAM平板上，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌均能水解七葉苷并與鐵離子反應(yīng)形成黑色的6,7-二羥基香豆素。因此，李斯特氏菌顯色平板和PALCAM平板選擇性分離培養(yǎng)的結(jié)果并不能直接鑒定單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。

API Listeria 李斯特菌屬鑒定試劑盒作為一款商業(yè)化鑒定系統(tǒng)，具有較好的鑒定效果，可以縮短常規(guī)生化鑒定所需時間，18 h～24 h 即可獲得鑒定結(jié)果。在一項單核細(xì)胞增生性李斯特菌和英諾克李斯特氏菌的鑒定試驗中，利用該系統(tǒng)97.7%的單核細(xì)胞增生性李斯特菌與99.4%的英諾克李斯特氏菌得到了正確的鑒定和分型。本次能力驗證中，使用該系統(tǒng)獲得了較好的鑒定結(jié)果，10 項生化反應(yīng)指標(biāo)均符合單核細(xì)胞增生性李斯特菌的特征。

VITEK 2 compact 自動微生物鑒定系統(tǒng)常用于微生物的鑒定，且符合我國食品微生物學(xué)檢驗相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。在一項覆蓋了20 個美國官方、第三方檢測實驗室的評價活動中，采用GP 鑒定卡對720株革蘭氏陽性菌進(jìn)行分析，其中714 株鑒定正確，0 株鑒定錯誤，0 株未鑒定，6 株未鑒定為革蘭氏陽性菌（由于革蘭氏染色觀察錯誤導(dǎo)致）。因此VITEK 2 compact 自動微生物鑒定系統(tǒng)是一種可靠的、快速的生化鑒定方法，且可以更好地排除人員操作對試驗結(jié)果的影響。

隨著檢驗技術(shù)的不斷革新，分子、色譜等方法也被用于李斯特氏菌的檢驗，如基于分子手段的PCR 技術(shù)，有學(xué)者建立了單增李斯特菌實時熒光定量PCR 檢測方法，也有在此技術(shù)上進(jìn)行擴(kuò)展和聯(lián)用的研究，均有較好的效果。再如，有學(xué)者采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對李斯特屬5 種細(xì)菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，還有學(xué)者采用高分辨率熱裂解氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)建立了檢測農(nóng)產(chǎn)品中單核細(xì)胞增生性李斯特菌的方法。另外，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）可以快速、可靠區(qū)分李斯特菌，具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，且該方法已經(jīng)形成推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)。但實際工作中，由于設(shè)備昂貴、耗材成本高、人員要求素質(zhì)高、數(shù)據(jù)庫覆蓋不全等因素，以上方法尚不能完全普及。

本次食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測能力驗證的參與和實施，有效地檢查了實驗室的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測能力，多種檢驗手段的使用也驗證了實驗人員的基本素質(zhì)和職業(yè)素養(yǎng)，保證和提升了實驗室的檢驗?zāi)芰唾|(zhì)量控制水平，對鞏固實驗室能力有著積極的作用。