李瑩,陳延儒,吳曉江,鄧夢菲,吳生文,萬茵,劉成梅,付桂明*

1(南昌大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品學(xué)院,國際食品創(chuàng)新研究院,江西 南昌,330047) 2 (四特酒有限責(zé)任公司,江西 樟樹,331200)

Millerozyma(Pichia)farinosaCBS 7064屬于畢赤酵母屬[1],對生物胺有降解作用[2],在白酒酒醅[3]、醬油[4]、泡菜[5]、大豆醬[6]中均有發(fā)現(xiàn)。目前,關(guān)于M.farinosa的性質(zhì)與應(yīng)用研究較少。酒類的發(fā)酵,會帶來高乙醇含量和高滲透壓等環(huán)境,引起細(xì)胞活力和發(fā)酵性能的改變[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),5%的乙醇便會使酵母降解生物胺能力大幅下降[9]。過高的乙醇含量會破壞離子平衡,導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和功能障礙,對線粒體中酶活性、細(xì)胞膜的組分和細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,抑制細(xì)胞的生長甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10-11]。

目前,提高酵母乙醇耐受性的方法有誘變菌株、基因工程、基因組改造等手段[12],或是提供營養(yǎng)底物和生物活性成分改善酵母菌株的環(huán)境耐受性[13-14]。其中適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化技術(shù)是預(yù)先將微生物暴露于脅迫環(huán)境中,以提高其適應(yīng)性。目前已被廣泛應(yīng)用于對菌株表型特征、生理生化特性、發(fā)酵性能的影響及其分子機(jī)制的研究[15]。如TOMS-PEJ等[16]研究發(fā)現(xiàn),短期適應(yīng)抑制劑的釀酒酵母生長延滯期明顯縮短,比生長速率顯著提高,菌株的乙醇生產(chǎn)能力提高了80%。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏菌株M.farinoseNCUF 304.1進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化,以期獲得乙醇耐受性得到提高的酵母菌株,并研究其與原始菌株間生長與性能的差異,為后續(xù)探究M.farinosaNCUF 304.1耐乙醇的內(nèi)在機(jī)制奠定前期基礎(chǔ),對其更好應(yīng)用于酒類釀造降解生物胺,提高酒類質(zhì)量安全有深遠(yuǎn)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株:實(shí)驗(yàn)室保藏的從特香型白酒酒醅中篩選所得菌株MillerozymafarinosaNCUF304.1。

培養(yǎng)基:酵母膏胨葡萄糖(yeast peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基。

1.2 試劑和儀器設(shè)備

試劑均購于西隴科學(xué)。

MMC-1全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)儀,洛陽華清天木生物科技有限公司;SP-756P型紫外可見分光光度計(jì),上海光譜儀器有限公司;DDS-307型電導(dǎo)率儀,上海雷磁儀器有限公司；日立SU8100型場發(fā)射掃描電鏡， 日本日立集團(tuán)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株適應(yīng)性進(jìn)化

適應(yīng)性進(jìn)化:M.farinosaNCUF304.1菌液按5%接種量接入新的YPD培養(yǎng)基中,混勻后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶,接入MMC-1全自動高通量微生物液滴培養(yǎng)儀,設(shè)置培養(yǎng)溫度28 ℃、起始乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%,以1%遞加,每一個梯度傳代馴化5～10代,收集最后一個梯度下生長狀況最優(yōu)的菌株。

1.3.2 耐乙醇能力測定

參照MO等[17]的方法,以不同乙醇體積分?jǐn)?shù)梯度(0%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%和13%)培養(yǎng)M.farinosa,進(jìn)行平板點(diǎn)種實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 高乙醇脅迫下酵母菌株生長的測定

向滅菌的50 mL YPD培養(yǎng)基(乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0%、8%),接種2%酵母種子液,28 ℃、180 r/min培養(yǎng),每4 h取樣,測定OD600值,計(jì)算平均值,繪制酵母生長趨勢曲線。

1.3.4 乙醇脅迫培養(yǎng)和樣液處理

乙醇脅迫培養(yǎng):基于生長曲線的結(jié)果,向滅菌的50 mL YPD培養(yǎng)基(乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0%、8%),接種2%酵母種子液,于28 ℃、180 r/min分別培養(yǎng)28、36、44 h。

樣液處理:收集5 mL酵母種子液,4 ℃,6 000 r/min,離心5 min,相同體積的無菌生理鹽水洗滌2次,加入5 mL蒸餾水,28 ℃水浴15 min,按上述條件離心5 min,保留上清液為實(shí)驗(yàn)樣液,菌體沉淀烘干至恒重,測其干重。

1.3.5 細(xì)胞泄漏內(nèi)容物含量測定

可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[18]，單位為 μg/g DCW；總糖含量測定采用蒽酮-硫酸法[19]，單位為mg/g DCW。

1.3.6 電導(dǎo)率測定

參照李沖偉等[20]的方法，單位為 μg/(cm·g DCW)。

1.3.7 丙二醛含量

參照文獻(xiàn)[21-22]的方法,單位為mmol/g DCW。

1.3.8 海藻糖含量

參照李艷玲[19]的方法提取海藻糖并測定其含量，單位為mg/g DCW。

1.3.9 菌體表面結(jié)構(gòu)觀察

參照LI等[14]的實(shí)驗(yàn)方法,使用掃描電子顯微鏡系統(tǒng)對酵母在不同乙醇含量下的酵母細(xì)胞表面形態(tài)進(jìn)行觀察。收集菌體,0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)洗滌菌體3次,加入2.5%的戊二醛固定液(pH 7.2)于4 ℃冰箱固定12 h,0.1 mol/L磷酸緩沖液洗滌菌體2次。乙醇體積分?jǐn)?shù)依次為30%、50%、70%、90%,脫水15 min,100%乙醇3次洗脫(每次20 min),叔丁醇置換乙醇2次,每次20 min。樣品冷凍干燥,噴金后用場發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行分析。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

上述實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行重復(fù),用Excel 2013軟件計(jì)算數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差和均值,用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析(P<0.05),用Origin 9軟件制作圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 適應(yīng)性進(jìn)化體系下酵母馴化結(jié)果

原始菌株自乙醇體積分?jǐn)?shù)超過5%,生長開始受抑制(圖1)。之后,對原始菌株進(jìn)行時(shí)間長達(dá)18 d的乙醇耐受適應(yīng)性進(jìn)化。最后在8%乙醇體積分?jǐn)?shù)下馴化10代后,分離純化得到2株生長量有明顯提升的菌株,分別命名為M.farinosaNCUF 304.1-1,M.farinosaNCUF 304.1-2。

圖1 乙醇含量對M.farinosa NCUF 304.1生長的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on growth of M.farinosa NCUF 304.1

圖2表明在8%乙醇體積分?jǐn)?shù)下,2株適應(yīng)性進(jìn)化菌株NCUF 304.1-1、NCUF 304.1-2相比原始菌株,生物量有顯著差異。24 h時(shí),M.farinosaNCUF 304.1-1的OD值約為6.60,比原始菌株高1.5。進(jìn)行生長量驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明馴化菌株NCUF 304.1-1、NCUF 304.1-2相比原始菌株,在8%乙醇體積分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)24 h后生長量分別提高了12.18%和7.98%(表1)。后續(xù)使用M.farinosaNCUF 304.1-1和原始菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株。

圖2 8%乙醇對出發(fā)菌株和進(jìn)化菌株生長的影響Fig.2 Effect of 8% ethanol on growth of original and evolved strains

表1 8%乙醇對出發(fā)菌株和進(jìn)化菌株OD值的影響Table 1 Effect of 8% ethanol on OD value of original and evolved strains

2.2 菌株與原始菌株耐受乙醇能力對比

不同乙醇含量下酵母生長情況如圖3所示。M.farinosaNCUF304.1和M.farinosaNCUF 304.1-1對乙醇的最大耐受體積分?jǐn)?shù)達(dá)到12%～13%,相比之下,NCUF 304.1-1有較好的乙醇耐受性,耐受度比原始菌株高出1%(體積分?jǐn)?shù)),在13%乙醇體積分?jǐn)?shù),菌液稀釋10倍后仍能形成較明顯的菌落,表明適應(yīng)性進(jìn)化后的菌株NCUF 304.1-1,提高了對乙醇的耐受性。

1-原菌液;10-稀釋10倍后的菌液圖3 出發(fā)菌株和進(jìn)化菌株耐受乙醇能力Fig.3 Ability of original and evolved strains to tolerate ethanol

2.3 乙醇脅迫對菌株生長的影響

圖4表明,0%乙醇體積分?jǐn)?shù)下,出發(fā)菌株和進(jìn)化菌株較快進(jìn)入生長期,而在8%乙醇下,酵母具有16～20 h的生長延滯期。M.farinosaNCUF 304.1-1顯示出更高的生長速率,并且最終生長量高于M.farinosa

NCUF 304.1,結(jié)果表明高體積分?jǐn)?shù)乙醇(8%)對酵母具有延緩生長,降低生物量的負(fù)面作用,但適應(yīng)性進(jìn)化后的M.farinosaNCUF 304.1-1受到的消極影響較少。

圖4 乙醇對酵母生長的影響Fig.4 Effect of ethanol on yeast growth

2.4 乙醇脅迫對菌株細(xì)胞膜的影響

酵母細(xì)胞膜是乙醇毒性作用的主要靶標(biāo)。乙醇對脂質(zhì)雙層具有擾動作用,破壞膜的結(jié)構(gòu)并抑制膜蛋白的活性[23],導(dǎo)致離子泄漏和電化學(xué)梯度的耗散,抑制營養(yǎng)物質(zhì)在膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收[24]。選擇8%乙醇下M.farinosaNCUF304.1和M.farinosaNCUF 304.1-1的指數(shù)生長期中期、穩(wěn)定期初期、穩(wěn)定期后期,分別為28、36和44 h,測定酵母的可溶性蛋白含量、總糖含量和電導(dǎo)率[25]以顯示膜通透性的變化,研究高體積分?jǐn)?shù)乙醇對酵母細(xì)胞膜的損害作用。如圖5-a所示,8%乙醇下,M.farinosaNCUF304.1和M.farinosaNCUF 304.1-1胞內(nèi)泄漏可溶性蛋白質(zhì)的含量呈現(xiàn)隨時(shí)間增加而降低,36 h后含量降低?？赡苁羌?xì)胞長期受到高體積分?jǐn)?shù)乙醇脅迫,膜破損較為嚴(yán)重,細(xì)胞內(nèi)容物有較大程度的泄漏。相比原始菌株,M.farinosaNCUF 304.1-1的泄漏量明顯減少(P<0.05)?？偺呛孔兓c可溶性蛋白含量變化趨勢相似(圖5-b)。

a-可溶性蛋白質(zhì)含量;b-總糖含量;c-電導(dǎo)率圖5 乙醇含量對細(xì)胞泄漏可溶性蛋白質(zhì)含量、總糖含量和電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the protein content,total sugar and electric conductivity of cell注:圖中各組中不同的小寫字母表示含量具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜通透性的重要指標(biāo),其值越大,細(xì)胞膜受害程度越重[20]。鞏林林等[26]研究發(fā)現(xiàn),高體積分?jǐn)?shù)乙腈會使酵母菌液電導(dǎo)率值不斷增加。圖5-c顯示,在28 h時(shí),2株菌電導(dǎo)率有顯著差異(P<0.05),且都高于無乙醇脅迫組。這一結(jié)果也論證8%乙醇使得酵母細(xì)胞膜通透性增加。NCUF 304.1-1在適應(yīng)性進(jìn)化過程中,可能激發(fā)了抵御乙醇損傷的機(jī)制,表現(xiàn)出較好的細(xì)胞膜完整性,獲得了優(yōu)于出發(fā)菌株的乙醇耐受性。

2.5 乙醇脅迫對菌株丙二醛含量的影響

丙二醛(malondialdehyde,MDA)常作為脂質(zhì)過氧化的指標(biāo),反映細(xì)胞膜脂過氧化的程度[27]。圖6表明,隨著乙醇脅迫時(shí)間的增加,8%的乙醇體積分?jǐn)?shù)下,出發(fā)菌株和進(jìn)化菌株的MDA的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,28～36 h時(shí),細(xì)胞受到乙醇引發(fā)的氧化脅迫,MDA含量因此增加,顯著高于無乙醇脅迫組(P<0.05)。趙素娟[28]研究表明乙醇脅迫下酵母細(xì)胞MDA含量幾乎為對照的3倍。M.farinosaNCUF 304.1的MDA含量高達(dá)10.147 mmol/g,細(xì)胞受到較嚴(yán)重的膜氧化損傷。進(jìn)化菌株M.farinosaNCUF 304.1-1減少了19.5% MDA生成量,表明其細(xì)胞受到的氧化傷害減少,自身抗氧化體系的增強(qiáng),提高了細(xì)胞膜的完整性。

圖6 乙醇含量對MDA含量的影響Fig.6 Effect of ethanol concentrations on MDA content

2.6 乙醇脅迫對菌株海藻糖含量的影響

酵母面臨高溫、乙醇等脅迫時(shí),會引起細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量不同程度的上升[11]。海藻糖可保護(hù)蛋白質(zhì)避免其發(fā)生變性[29]。28 h時(shí)8%體積分?jǐn)?shù)下出發(fā)菌株和進(jìn)化菌株海藻糖積累較少,細(xì)胞處于指數(shù)生長期,分配給海藻糖合成的能量較低。44 h時(shí)8%乙醇下海藻糖積累量下降,可能是由于酵母細(xì)胞長時(shí)間處于脅迫環(huán)境下,細(xì)胞死亡量增加,海藻糖含量顯著降低(圖7)(P<0.05)。值得注意的是,M.farinosa應(yīng)對高乙醇脅迫環(huán)境時(shí),海藻糖含量并沒有顯著的上升。相類似的是,MO等[17]發(fā)現(xiàn)Kluyveromycesmarxianus處于高濃度乙醇脅迫環(huán)境時(shí),海藻糖代謝基因并沒有出現(xiàn)上調(diào)(低乙醇濃度脅迫時(shí)出現(xiàn)),而固醇生物合成和分泌的途徑均被激活,K.marxianus激發(fā)了獨(dú)特的途徑抵抗不同乙醇濃度造成的細(xì)胞損傷。M.farinosaNCUF 304.1-1海藻糖的積累量低于M.farinosaNCUF304.1,可能原因是M.farinosaNCUF 304.1-1在適應(yīng)性進(jìn)化中,誘導(dǎo)了除海藻糖外的其他自身抗氧化體系的增強(qiáng)。然而,具體的途徑還有待進(jìn)一步的研究。

圖7 乙醇含量對出發(fā)菌株和進(jìn)化菌株海藻糖含量的影響Fig.7 Effect of ethanol concentrations on trehalose content of original and evolved strains

2.7 乙醇脅迫對菌株表面結(jié)構(gòu)的影響

如圖8-a和8-b所示,無乙醇脅迫時(shí),出發(fā)菌株和進(jìn)化菌株的菌體為橢圓形,細(xì)胞表面光滑,菌體飽滿。28和36 h時(shí),8%乙醇下2株菌都出現(xiàn)明顯的表面凹陷和褶皺,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)嚴(yán)重的變形(圖8-c、8-d、8-e和8-f)。相比之下,進(jìn)化菌株NCUF 304.1-1相比出發(fā)菌株NCUF304.1菌體損傷較小,受損細(xì)胞數(shù)的比例降低。8%乙醇脅迫酵母44 h后,出發(fā)菌株NCUF304.1變形嚴(yán)重,細(xì)胞表面出現(xiàn)明顯裂縫,進(jìn)化菌株NCUF 304.1-1變形程度較輕,細(xì)胞表面可觀察到的裂縫較少,相比原始菌株具有較好的膜完整性(圖8-g,8 h)。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,適應(yīng)性進(jìn)化獲得的進(jìn)化菌株M.farinosaNCUF 304.1-1,在8%乙醇體積分?jǐn)?shù)下,相比原始菌株,縮短了4 h的生長延滯期,增加了生物量,其耐受乙醇能力提高至13%乙醇。細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏減少,細(xì)胞膜完整性提高,細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)破損較少,細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量顯著降低19.5%,抵抗氧化損傷能力有所增加,但其海藻糖含量的積累量降低。

a-NCUF304.1(0%乙醇);b-NCUF 304.1-1(0%乙醇);c-NCUF304.1(8%乙醇,28 h);d-NCUF 304.1-1(8%乙醇,28 h);e-NCUF304.1(8%乙醇,36 h);f-NCUF 304.1-1(8%乙醇,36 h);g-NCUF304.1(8%乙醇,44 h);h-NCUF 304.1-1(8%乙醇,44 h)圖8 不同乙醇含量下酵母菌株掃描電子電鏡觀察圖(5 000×)Fig.8 SEM examination of yeast in different ethanol concentrations (5 000×)

適應(yīng)性進(jìn)化菌株M.farinosaNCUF 304.1-1的乙醇耐受性顯著提高,其細(xì)胞膜完整性和抗氧化性及表面結(jié)構(gòu)完整性都優(yōu)于原始菌株,對于M.farinosaNCUF 304.1-1應(yīng)用于白酒、果酒釀造,提高其生存性及降低酒體生物胺能力,提高酒品安全質(zhì)量有重要意義。