章安源，張傳津，王洪濤，張 琦，陳志強(qiáng)，李有志，魏秀麗，牛華星，楊修鎮(zhèn)，薄永恒，劉霄飛，魏茂蓮，田學(xué)磊，陳 玲 *

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250022；2.濰坊海關(guān)，山東濰坊 261041；3.青島信諾邦生物科技有限公司，山東青島 266000，)

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素阿奇霉素抗菌譜廣，臨床上廣泛用于治療敏感菌所致呼吸道、皮膚和軟組織感染[1-3]。有些養(yǎng)殖戶在化痰清肺、平喘止咳等中獸藥散劑中違規(guī)添加阿奇霉素, 目的是控制畜禽咳喘病的治療，我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2005年8月曾發(fā)布了第560號(hào)令,取消了阿奇霉素作為獸藥使用。非法添加人用抗生素，不僅易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性問(wèn)題,而且增加動(dòng)物源性食品中阿奇霉素的殘留風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)中獸藥散劑中阿奇霉素的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，僅有含量測(cè)定相關(guān)的液相色譜方法，專屬性不強(qiáng)，且中藥組分的干擾較大，本實(shí)驗(yàn)擬建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測(cè)中獸藥散劑中違規(guī)添加的阿奇霉素含量，為中獸藥單方或復(fù)方制劑中非法添加阿奇霉素含量的定性、定量檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器 AE-240電子天平(瑞士Mettlrer Toledo 公司)； Agilent 1260-6460高效相色譜四極桿電離噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)； KQ-250DB超聲儀(昆山市超聲儀有限公司),5810R高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)，0.22 μm的濾膜為美國(guó)Waters 公司。

1.2 藥品及試劑 阿奇霉素(來(lái)源：CAS公司，編號(hào)：83905-01-5，純度≥97%)。甲酸、乙腈(色譜純，德國(guó)Merk公司，)；超純水。高純氮，高純氬(純度均為99.99%，濟(jì)南德陽(yáng)氣體有限公司。

1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，100 mm×3.0 mm，粒徑2.7 μm，或性能相當(dāng)者；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：水溶液(0.1%甲酸)；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。高效液相色譜梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of gradient elution

1.4 質(zhì)譜條件 電離方式：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描(ESI+)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：9.0 L/min；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11.0 L/min；碰撞氣：40 psi；毛細(xì)管電壓：4 kV；測(cè)試藥物定性、定量離子和碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)Tab 2 Mass Spectrometric Determination of Parameter

1.5 樣品制備

1.5.1 陰性樣品 清肺止咳散，來(lái)源：山東某獸藥企業(yè)；批號(hào)20201101。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 精密稱取阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品10.31 mg(準(zhǔn)確至0.01 mg)，置10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻, 即得1000 μg /mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20 ℃冰箱保存，貯存期3個(gè)月。

1.5.3 樣品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取1.5.1項(xiàng)下樣品0.2 g(精確到0.001 g)于250 mL三角燒瓶中，加入50 mL 40%乙腈溶液超聲提取15 min，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加初始流動(dòng)相(1.3)稀釋至刻度。用濾紙過(guò)濾，收集續(xù)濾液。準(zhǔn)確吸取續(xù)濾液1.0 mL，至10 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相(1.3)稀釋至刻度，搖勻，濾膜過(guò)濾，過(guò)濾液待測(cè)。同時(shí)按上述步驟做樣品空白試驗(yàn)。

1.5.4 空白基質(zhì)溶液的制備 稱取0.2 g 樣品50 份，按照1.5.3項(xiàng)下方法處理后即得空白基質(zhì)溶液。

1.5.5 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備 精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL，置100 mL容量瓶中，加空白基質(zhì)溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得10 μg /mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.5.6 陽(yáng)性添加樣品的制備 準(zhǔn)確稱取阿奇霉素5、10、20、50 mg加入到陰性空白散劑樣品100 g中，混勻，即每1 kg分別添加阿奇霉素50、100、200、500 mg，每個(gè)添加量制備3份平行樣，按待測(cè)樣品制備方法(1.5.3項(xiàng))制備陽(yáng)性添加樣品，在上述液相色譜條件(1.3項(xiàng))和質(zhì)譜條件(1.4項(xiàng))進(jìn)行測(cè)定，每份樣品至少進(jìn)樣2次，取平均值。

1.5.7 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確吸取5.0 mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(10 μg/mL)，至100 mL容量瓶中，用空白基質(zhì)溶液稀釋至刻度，搖勻，得500 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取500 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用空白基質(zhì)溶液倍比稀釋，得5、10、25、50、100、125、250 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)系列工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性考察 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可有效地分離各離子。5、10、25、50、100、125、250 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定后，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中阿奇霉素定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)的阿奇霉素濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。阿奇霉素在5～250 ng/mL范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=1309.94X+119.96，其決定系數(shù)R2為0.9993，線性關(guān)系良好。

2.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液50 ng/mL(10 μL)，連續(xù)進(jìn)樣6次。以峰面積計(jì)算，得出阿奇霉素峰面積的RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)為1.8%。表明儀器精密度良好，符合檢測(cè)要求。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性 配制阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液將其分裝為3瓶，分別將其儲(chǔ)存在冷凍、冷藏和室溫條件下，每周稀釋上機(jī)，考察穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，-20 ℃和4 ℃儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液3個(gè)月內(nèi)無(wú)明顯差異，25 ℃存儲(chǔ)條件下略有差異。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液穩(wěn)定性考察Tab 3 Stability of standard stock solution

2.3.2 基質(zhì)添加阿奇霉素穩(wěn)定性 清肺止咳散中添加阿奇霉素(50 mg/kg)后，分別將其儲(chǔ)存在冷凍、冷藏和室溫條件下，稀釋至10 ng/mL上機(jī)，并且每周將不同儲(chǔ)存狀態(tài)下的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和中間液進(jìn)行稀釋上機(jī)，即用第0天的數(shù)據(jù)為標(biāo)曲單點(diǎn)對(duì)每周的數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在冷凍(-20 ℃)條件下儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)90 d內(nèi)，無(wú)降解。而在室溫條件下儲(chǔ)存的阿奇霉素儲(chǔ)備液從第2個(gè)月開(kāi)始出現(xiàn)降解；阿奇霉素中間液從第1個(gè)月就開(kāi)始出現(xiàn)降解，第2個(gè)月時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)明顯降解。結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和GB/T 27404-2008推薦的有效期，阿奇霉素儲(chǔ)備液和中間液的有效期最終定為3個(gè)月。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 清肺止咳散添加阿奇霉素溶液穩(wěn)定性Fig 1 Stability of Qingfeizhike powder added azithromycin solution

2.4 回收率試驗(yàn) 50、100、200、500 mg/kg四個(gè)添加濃度下，平均回收率在89.1%～98.6%(表4)。批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<1.6%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%。

表4 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab 4 Result of recovery and precision for azitromycin

2.5 檢出限和定量限 空白基質(zhì)按確定的步驟處理后，測(cè)定結(jié)果表明：在相應(yīng)的保留時(shí)間，空白基質(zhì)對(duì)所測(cè)分析物無(wú)干擾。在空白樣品中添加阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品，按確定的提取方法處理后，經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，計(jì)算信噪比。添加濃度為25 mg/kg時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)溶液信噪比(S/N))≥3，確定為方法的檢出限。添加濃度為50 mg/kg時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)溶液顯示信噪比(S/N))≥10，作為此方法定量限。檢測(cè)限和定量限滿足檢測(cè)要求。

2.6 質(zhì)譜圖 空白樣品、對(duì)照溶液及陽(yáng)性添加樣品的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2～圖4。

圖2 空白樣品特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 2 Extraction ion chromatograms of the blank sample

圖3 對(duì)照溶液提取離子色譜圖Fig 3 Extraction ion chromatograms of the contrast solution

圖4 陽(yáng)性添加樣品特征離子質(zhì)量色譜圖Fig 4 Extraction ion chromatograms of the positive added sample

3 討論與結(jié)論

3.1 前處理方法的選擇與優(yōu)化 為確保散劑中添加阿奇霉素有效成分全部溶解，分別用甲醇、乙腈、水、20%乙腈水、40%乙腈水、60%乙腈水、80%乙腈水、乙腈：0.1%甲酸水(40∶60)、乙腈：0.2%甲酸水(40∶60)、乙腈：0.5%甲酸水(40∶60)對(duì)不同批號(hào)的樣品稀釋并超聲提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇、水提取時(shí)，提取得到供試品雜質(zhì)成分多，回收率不高；用乙腈提取后的提取液較為清澈，基質(zhì)干擾小。因?yàn)榘⑵婷顾卦谥行运芤褐邢鄬?duì)較穩(wěn)定，因此，決定調(diào)節(jié)乙腈和水的比例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40%乙腈水提取后的供試品溶液基質(zhì)干擾最小。阿奇霉素屬于弱堿性化合物，易溶于酸性水溶液[4]，為進(jìn)一步確定甲酸水的用量，研究比較甲酸0.1%、0.2%、0.5%用量時(shí)，結(jié)果表明甲酸用量為0.1%時(shí)，超聲提取15 min，且基質(zhì)效益無(wú)明顯差別，雜質(zhì)干擾少，峰形對(duì)稱，阿奇霉素回收率較高。故選擇初始流動(dòng)相處理樣品?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液采用空白基質(zhì)溶液定容，空白基質(zhì)溶液在與阿奇霉素對(duì)照品相同保留時(shí)間處，均無(wú)色譜峰出現(xiàn)，證明在很大程度上基質(zhì)效應(yīng)小，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度高。

3.2 液相色譜條件的選擇與優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)分別考察甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液分離情況，摒棄了乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(12∶88)作為流動(dòng)相，降低了色譜柱因磷酸鹽易堵的風(fēng)險(xiǎn)[5-8]。不斷調(diào)整流動(dòng)相比例：甲醇和乙腈由30%下降到10%，最終選擇了乙腈-0.1%甲酸水(1∶9，體積比)為初始流動(dòng)相，不僅能使阿奇霉素很好的分離，其特征離子質(zhì)量色譜圖的峰形和分離度好，降低了檢測(cè)成本，有機(jī)試劑使用量較少，有利環(huán)保。

3.3 質(zhì)譜條件的選擇與優(yōu)化件的選擇與優(yōu)化 采用1.0 μg/mL的阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液在不接色譜柱的條件下，分別用電噴霧電離正離子模式(ESI+)和負(fù)離子模式(ESI-)進(jìn)行母離子全掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素正離子模式的[M+H]+為m/z749.3，負(fù)離子模式下的[M-H]-為m/z747.3，[M+H]+信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于[M-H]-。在正離子模式(ESI+)下對(duì)阿奇霉素進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜全掃描，得到m/z591.1、m/z158.3、m/z116.1、m/z83.1四個(gè)相對(duì)信號(hào)較高的子離子。利用安捷倫Optimizer軟件對(duì)阿奇霉素的子離子碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，獲得最佳的儀器條件。結(jié)合樣品基質(zhì)的質(zhì)譜圖最終選取離子豐度最高、本底干擾最小的m/z749.3>591.1作為定量離子，m/z749.3>158.3作為定性離子。

本實(shí)驗(yàn)建立了中獸藥散劑中非法添加阿奇霉素含量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，回收率較高，各項(xiàng)性能指標(biāo)均達(dá)到了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求，同時(shí)基質(zhì)干擾小，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢出限低，靈敏度高，適用于清肺止咳散中非法添加阿奇霉素的定性、定量檢測(cè)，為治理整頓中獸藥中添加違禁藥物，提供了檢測(cè)參考和技術(shù)支撐。