楊芬芳，呂繼偉，趙樂凱，郝智慧

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心，北京 100094)

犬泌尿道炎，中醫(yī)稱為“淋證”，是犬臨床上常見和多發(fā)的疾病之一，在普通內(nèi)科病中的發(fā)病率僅次于消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病。此病四季均可發(fā)病，且在各種年齡、性別、品種中均有發(fā)現(xiàn)，年齡偏大的犬發(fā)病率較高[1]。淋證根據(jù)主癥不同，常分為熱淋、血淋、砂淋和膏淋等。證候不同，治法也會有差異，熱淋治則為清熱、利濕、通淋，血淋治則為清熱、涼血、止血[2-3]。黃馬通淋口服液的處方來源于中藥成方制劑腎炎片[4]，是由一枝黃花、車前草、馬鞭草、白茅根等六味藥物配伍制成，本品具有清熱解毒，利水通淋之功效[5-6]，主要用來治療犬淋癥。本方中一枝黃花清熱解毒，疏散風(fēng)熱為主藥；馬鞭草清熱解毒，活血通經(jīng)，利水消腫[7-9]；白茅根清熱利尿，涼血養(yǎng)陰[10-11]；車前草清熱利濕，通淋排石[12]，葫蘆殼利水消腫為輔藥，協(xié)助主藥一枝黃花清濕熱，利水腫[13-14]；白前利氣疏導(dǎo)，促進(jìn)濕熱排出為佐藥[15]。配伍所得的黃馬通淋口服液，具有清熱解毒，利濕通淋的藥效。因此，黃馬通淋口服液在臨床上對熱淋和血淋有更明顯的效果。

本制劑由腎炎片更改劑型而來，腎炎片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)非常簡單，僅有一項(xiàng)黃酮類的顏色鑒別，無法區(qū)分單味藥材，也沒有有效成分的定量控制[4,16]，目前未見黃馬通淋口服液完善的定性和定量控制方法。為了更加全面評價新制劑的質(zhì)量，保證其療效，本研究對黃馬通淋口服液進(jìn)行了一枝黃花的定性鑒別，對車前草中有效成分毛蕊花糖苷進(jìn)行了定量測定，增加了該制劑可以定性定量質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材 料

1.1 試藥 供試品黃馬通淋口服液(批號20170701、20170702、20170703；20170801、20170802、20170803、20170804；20170901、20170903、20170905)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，由山東信得科技股份有限公司生產(chǎn)。毛蕊花糖苷，批號：111530-201713；一枝黃花對照藥材，批號：121433-201304，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 儀器 Agilent 1260色譜儀，DAD檢測器；BT125D電子天平：賽多利斯；AL204分析天平：METTLER TOLEDO；DS-673分析天平：上海寺岡電子有限公司；KQ-5200DA超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司；ZF-90型暗箱式紫外透射儀：上海顧村電光儀器廠。

1.3 試劑 G薄層預(yù)制板：青島海洋化工廠；苯、乙酸乙酯、甲醇、甲酸：萊陽市康德化工有限公司(AR)；乙醇、磷酸：煙臺三和化學(xué)試劑有限公司(AR)；乙腈：TEDIA公司(GR)；水為純化水；其余所有試劑均為AR。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 參照《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部“制劑通則”附錄0110合劑部分及相關(guān)指導(dǎo)原則中制劑性狀的研究規(guī)定，對10批本品進(jìn)行外觀形態(tài)、色澤特征目視觀察，氣味鼻聞口嘗方法考察。10批本品結(jié)果見表1。根據(jù)十批本品的性狀觀察，不同批次產(chǎn)品的顏色會有差異，故綜合工藝條件、放大效應(yīng)、實(shí)際生產(chǎn)等因素，本品的性狀為：棕色至棕褐色液體，氣微，微苦。

表1 性狀觀察結(jié)果表Tab 1 Observation results of ten batches of samples

2.2 鑒別

2.2.1 顏色鑒別 取本品10 mL，蒸干，加水2 mL，研成糊狀，加苯15 mL，研磨15 min分液取苯層，待揮干后，加入1 mL乙醇溶解，再加入鹽酸3 mL，鎂粉少許，即顯橙黃色(圖1)。

1：20170701批樣品；2：20170702批樣品；3：20170703批樣品圖1 黃馬通淋口服液顏色鑒別圖Fig 1 Color identification of HuangmaTonglin Oral liquid

2.2.2 一枝黃花的薄層定性鑒別 取本品5 mL，置于15 mL甲醇中，搖勻，濾過，濾液蒸干，溶解在15 mL水中，用15 mL乙酸乙酯分別提取2次，將乙酸乙酯液收集、合并、蒸干，所得物以2 mL甲醇溶解，即得。另取一枝黃花對照藥材2.5 g，加入50 mL的水，煎煮2 h，濾過，將濾液濃縮至5 mL，從加入甲醇15 mL，同法制備。照薄層色譜法(附錄0502)試驗(yàn)，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶0.5∶0.5)為展開劑，吸取上述兩種溶液各3 μL，分別在含4%磷酸氫二鈉的硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，展開，取出，晾干，將薄層板置365 nm的紫外光燈下檢視。供試品溶液與相對應(yīng)的對照藥材溶液相同位置顯相同的斑點(diǎn)，陰性樣品溶液對主斑點(diǎn)不干擾(圖2)。

1：一枝黃花對照藥材；2：20170701批樣品；3：20170702批樣品；4：20170703批樣品；5：陰性樣品圖2 黃馬通淋口服液TLC圖Fig 2 TLC of Huangma Tonglin Oral liquid

2.3 檢查

2.3.1 pH值 照《中華人民共和國獸藥典》2015版二部(附錄0631)pH值測定法，檢測生產(chǎn)的10批黃馬通淋口服液的pH值，見表2。十批樣品檢測結(jié)果顯示，pH值在4.7～5.2，考慮到工藝條件、放大效應(yīng)、實(shí)際生產(chǎn)等因素，暫定本品的pH值范圍為4.0～5.5。

表2 pH值測定結(jié)果表Tab 2 Results of pH measurement

2.3.2 相對密度 取本品，照《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部附錄0601相對密度測定法項(xiàng)下的第1法比重瓶法項(xiàng)下的方法試驗(yàn)。10批黃馬通淋口服液的相對密度結(jié)果見表3。檢測結(jié)果顯示，十批樣品的相對密度為1.05～1.11，考慮到規(guī)模化生產(chǎn)可能帶來的不確定因素等問題，暫定本品的相對密度不低于1.02。

表3 相對密度結(jié)果表Tab 3 Relative density results table

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件 選用Agilent Zobax Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以乙腈-0.2%磷酸水溶液(20∶80)為流動相，檢測波長為330 nm，流速為每分鐘1.0 mL；柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.4.2 溶液的制備

2.4.2.1 對照品溶液的制備 用甲醇溶解適量的毛蕊花糖苷，制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.4.2.2 供試品溶液的制備 取本品，搖勻，精密量取5 mL，置于25 mL的量瓶中，加入10 mL甲醇搖勻，再加甲醇至刻度，用力搖勻，濾過，除去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2.3 缺失車前草陰性對照品溶液配制 按黃馬通淋口服液處方比例及制備工藝制備缺車前草藥材的口服液，搖勻后量取5 mL，置于25 mL的量瓶中，加入10 mL甲醇搖勻，再加甲醇至刻度，用力搖勻，濾過，除去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 專屬性考察 對照品溶液、供試品溶液(批號20170701)和陰性樣品溶液分別吸取各10 μL，進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷峰與相鄰峰可以達(dá)到較好的分離，分離度>1.5，陰性樣品溶液在毛蕊花糖苷峰相應(yīng)的位置上無干擾(圖3)。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取毛蕊花糖苷對照品11.2 mg(含量以92.5%計(jì))，將其置于50 mL容量瓶中，加60%甲醇搖勻使溶解，再加少量60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。分別取適量儲備液，用60%甲醇稀釋成10.36、25.90、51.80、77.70、103.60、207.20 μg/mL的一系列濃度的對照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，于高效液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄色譜圖，測定各個濃度的峰面積。結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/mL)，峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=13.108X+23.992(R2=0.9992)。如圖4所示，毛蕊花糖苷在10.36～207.20 μg/mL之間存在著良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取20170701批供試品溶液10 (L，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件，重復(fù)檢測6次，6次結(jié)果的RSD=0.61%，表明以該方法、該儀器測定毛蕊花糖苷時精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取20170701批的樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法平行配制6份供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)行檢測，6份樣品的RSD=0.24%，表明該方法的重復(fù)性良好。

A．對照品；B．供試品；C．陰性樣品A. Reference substance; B. The product; C. The negative samples圖3 黃馬通淋口服液HPLC圖Fig 3 HPLC of Huangma Tonglin Oral liquid

圖4 毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 4 Standard curve of Verbascoside

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 配制20170701批號的供試品溶液，于0，2，4，6，8，12 h，分別精密吸取10 (L，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件，檢測分析，幾次結(jié)果間的RSD=0.80%，表明該樣品溶液放置12 h相對穩(wěn)定。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取本品(批號20170701，毛蕊花糖苷含量0.26 mg/ mL)2.5 mL，精密量取9份，分別置25 mL量瓶中，3份一組，共三組，備用，添加毛蕊花糖苷對照品，再按2.2.2項(xiàng)下配液，分別制成80%、100%、120%三個濃度水平的加樣供試品溶液。精密吸取10 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，檢測分析，進(jìn)行回收率的計(jì)算，見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表Tab 4 Recovery test results of sample addition

2.4.9 樣品測定 對10批黃馬通淋口服液，進(jìn)行測定，計(jì)算黃馬通淋口服液中毛蕊花糖苷的含量，見表5。

表5 毛蕊花糖苷含量結(jié)果表Tab 5 Determination of Verbascosidecontent in the samples

3 討論與結(jié)論

3.1 薄層色譜鑒別指標(biāo)的選擇 方中一枝黃花清熱解毒，疏散風(fēng)熱為君藥?！吨腥A人民共和國獸藥典》2015年版二部一枝黃花藥材項(xiàng)下對一枝黃花藥材的薄層色譜鑒別有成熟的方法，因此，首先選擇對一枝黃花進(jìn)行薄層色譜鑒別的研究。但是在研究的過程中發(fā)現(xiàn)，采用獸藥典中規(guī)定的乙酸乙酷―甲醇―甲酸‐水(8∶1∶1∶1)為展開劑，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，斑點(diǎn)不清晰，故需要進(jìn)一步優(yōu)化薄層色譜條件。

3.2 薄層色譜條件的優(yōu)化 通過調(diào)整展開劑、薄層板、展開溫度、點(diǎn)樣量、預(yù)飽和時間等[17]能使薄層色譜達(dá)到較好地展開效果。結(jié)合參考文獻(xiàn)[18,19]方法，更改展開劑比例進(jìn)行考察，試驗(yàn)表明，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶0.5∶0.5)為展開劑，供試品斑點(diǎn)清晰，陰性樣品無干擾，分離度好。此鑒別方法操作簡單，色譜特征斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性良好，專屬性強(qiáng)，可用來定性鑒別黃馬通淋口服液中的一枝黃花。

3.3 含量測定指標(biāo)的選擇 該處方中一枝黃花、馬鞭草、車前草3個藥味在《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)中均有的含量測定方法。前期也對3味藥材分別進(jìn)行了含量測定研究。但是在現(xiàn)有臨床有效的水提工藝下，君藥一枝黃花中蘆丁的提取率較低，可能與蘆丁的水溶性有關(guān)；對君藥中的綠原酸也進(jìn)行了研究，但是綠原酸易分解[20]；馬鞭草在處方中用量相對較小，且其指標(biāo)成分齊墩果酸和熊果酸水溶于水[21]；對車前草中毛蕊花糖苷和大車前苷進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)大車前苷提取率偏低，最終選擇以毛蕊花糖苷作為含量測定指標(biāo)。

3.4 含量測定條件的優(yōu)化 液相色譜條件優(yōu)化包括提取溶劑、流動相、柱溫、流速等[22]。本研究考察了乙腈-0.1%甲酸溶液(17∶83)、乙腈-0.2%磷酸(20∶80)兩種流動相，結(jié)果以乙腈-0.2%磷酸(20∶80)為流動相，保留時間適宜，分離度好，因此選擇以乙腈-0.2%磷酸(20∶80)為流動相；二極管陣列檢測器進(jìn)行波長掃描，毛蕊花糖苷在330 nm附近有較大光譜吸收，選擇以330 nm為檢測波長。研究中比較了不同色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、InertSustain C18、Phenomenex Gemini C18；不同流速0.9 ml/min、1.0 ml/min、1.1 ml/min；不同柱溫25 ℃、30 ℃、35 ℃等條件，樣品中毛蕊花糖苷與其他峰均能達(dá)到基線分離。最終選定的色譜條件下，分離度高、峰型好，陰性無干擾，指標(biāo)成分進(jìn)樣濃度與峰面積之間存在著良好的線性關(guān)系，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好；對處方中毛蕊花糖苷的含量測定適用。

4 結(jié) 論

腎炎片做為臨床用中藥，療效確切，中獸藥通過“多成分、多作用、多靶點(diǎn)”在我國獸醫(yī)醫(yī)療系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用[23]，因此，本研究在腎炎片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)對以腎炎片為處方來源的黃馬通淋口服液，進(jìn)行了全面的質(zhì)量評價?？陀^地進(jìn)行了性狀、pH值、相對密度、黃酮類顏色鑒別、一枝黃花薄層鑒別、毛蕊花糖苷含量測定的研究和規(guī)定，完善了鑒別項(xiàng)、增加了含量測定項(xiàng)，建立了較全面的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為控制黃馬通淋口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了較全面的依據(jù)。建立的一枝黃花的薄層鑒別方法方法操作簡單、重現(xiàn)性良好、專屬性強(qiáng)；建立的車前草藥材中毛蕊花糖苷含量測定方法，方法簡單、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高，同時可用來控制黃馬通淋口服液的質(zhì)量，也為提高腎炎片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。