徐婷婷

摘要：本文將5-48號菌株作為出發(fā)菌株、得到原生質(zhì)體，展開針對性的處理，獲取得到高產(chǎn)菌株7-23，通過對兩種菌株的對比分析，對大觀霉素菌種選育的原生質(zhì)體—再生技術(shù)展開具體論述，旨在全面提高菌株生產(chǎn)能力，為今后大觀霉素菌種選育打下堅實基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大觀霉素;原生質(zhì)體;再生技術(shù)

引言：大觀霉素作為氨基環(huán)醇類抗生素的一種，通過壯觀鏈霉菌制備而成，在臨床上主要用于治療急性淋病，還可以將大觀霉素用于農(nóng)藥噴灑，治療效果突出且明顯，使用安全且穩(wěn)定。

1.大觀霉素菌種制備和發(fā)酵

對于原生質(zhì)體-再生技術(shù)，無論是在慶大霉素、吉他霉素，還是在螺旋霉素、泰樂星的菌種培育中都能夠起到良好的應(yīng)用效果。對于大觀霉素，壯觀鏈霉菌作為產(chǎn)生菌、原菌種號額設(shè)置為47號，通過分離操作獲取得到7-23號。在恒溫作用下一共培養(yǎng)8～10天，通過三級振蕩培養(yǎng)，將其放置到瓶中用于檢測生物效價。較為典型的大觀霉素菌種制備和發(fā)酵工藝主要表現(xiàn)為：第一，在原始細(xì)胞庫冷凍孢子。第二，在工作細(xì)胞庫冷凍孢子。第三，進行一定時間段的斜面孢子培養(yǎng)。第四，種瓶培養(yǎng)。第五，展開一級種子液培養(yǎng)工作。第六，二級種子液培養(yǎng)工作。第七，定期進行發(fā)酵液的組織培養(yǎng)。大觀霉素生物效價測定方法則采用管碟法進行，而大觀霉素試驗指示菌則為肺炎克雷伯氏菌。

2.大觀霉素的選育方法

現(xiàn)有的大觀霉素菌種選育方法主要包括以下幾種，第一種即為誘變育種，作為一種較為傳統(tǒng)的菌種育種方式，應(yīng)用時間長、應(yīng)用范圍廣、應(yīng)用價值高，將其與其他誘變方法相結(jié)合，還能夠顯著提高誘變效果、促使產(chǎn)物具有高抗性。但是需要注意的是，采用誘變育種方法本身的隨機性影響很大，采用誘變育種很容易促使最終生成的菌株難以達(dá)成目標(biāo)要求，自身性能出現(xiàn)缺陷，甚至生成變異株[1]。第二種是原生質(zhì)體育種，原生質(zhì)體育種方法的應(yīng)用原理便在于充分利用原生質(zhì)體，在沒有細(xì)胞壁的影響下，整個誘變處理過程更加簡單方便，誘變效益也更加突出、正突率幾率也能夠顯著提高。與此同時，對于原生質(zhì)體育種，無論是生成原生質(zhì)體，還是再生原生質(zhì)體，都能夠直接進行分離純化菌種，質(zhì)體突變的可能性也會相應(yīng)提高。

3.原生質(zhì)體制備和處理

3.1原生質(zhì)體制備

對于大觀霉素原生質(zhì)體的制備工作，需要預(yù)先準(zhǔn)備好新鮮母瓶，具體規(guī)格為0.5%甘氨酸、3粒玻璃珠，一共需要培養(yǎng)42小時。需要預(yù)先提取出10ml，并按照2500r/min的轉(zhuǎn)速進行離心處理10分鐘，棄上清液。之后，需要清洗緩沖液2次，并按照3000r/min的轉(zhuǎn)速進行離心處理10分鐘，棄上清液，最終制備得到酶解用菌體。

3.2酶解

對于已經(jīng)清洗完成的濕菌體，需要相應(yīng)添加容量為8ml、濃度為4mg/ml的雞蛋清溶菌酶。整個酶解過程如果發(fā)現(xiàn)酶解中的菌絲體懸液在較短時間內(nèi)就開始變清，則表示已經(jīng)形成大量原生質(zhì)體。并準(zhǔn)備好顯微鏡進行具體觀察，一旦發(fā)現(xiàn)較多數(shù)量、較大面積的亮點，則表示已經(jīng)終止酶解環(huán)節(jié)，實現(xiàn)大量原生質(zhì)體的釋放工作。

3.3紫外線誘變處理

對于紫外線誘變處理原生質(zhì)體，需要預(yù)先準(zhǔn)備好經(jīng)過上述處理的原生質(zhì)體懸浮液，原生質(zhì)體懸浮液容量為5ml，并將其直接移置到9cm定量培養(yǎng)皿，工作人員輕輕進行懸浮液的攪動，促使其能夠處于紫外線照射下，照射時間控制在90s。當(dāng)原生質(zhì)體懸浮液適當(dāng)稀釋之后，則需要在溫度為28℃的分離再生培養(yǎng)基直接培養(yǎng)7天左右，從而完成整個原生質(zhì)體的紫外線誘變處理[2]。

4.試驗結(jié)果分析

4.1菌株單菌落考察情況

對于大觀霉素的菌種選育，菌落形態(tài)一共有三種，分別是梅花型、饅頭型帶紅邊以及草帽型，搖瓶效價則分別為230μg/ml、230μg/ml、220μg/ml。按照不同菌落形態(tài)展開正交試驗，將影響因素分別設(shè)置為單菌落形態(tài)、單菌落生長周期、單菌落直徑大小。其中，當(dāng)影響因素為單菌落形態(tài)，將A1、A2、A3分別設(shè)置為梅花型、饅頭型帶紅邊、草帽型。當(dāng)影響因素為單菌落生長周期，將B1、B2、B3分別設(shè)置為10天、9天、8天。當(dāng)影響因素為單菌落直徑大小，將C1、C2、C3分別設(shè)置為3.0mm、3.5mm、4.0mm。通過正交試驗最終獲取得到最佳組合結(jié)果為A2B3C2，也就是優(yōu)選菌落為單菌落形態(tài)為饅頭型帶紅邊、單菌落生長周期設(shè)置為8天、單菌落直徑大小設(shè)置為3.5mm。

4.2 7-23號菌株初篩、復(fù)試、放大結(jié)果

7-23號菌株和對照菌株5-48相比，復(fù)試結(jié)果超過22%。當(dāng)其處于18m3的發(fā)酵罐中，7-23號菌株和對照菌株5-48相比，放大結(jié)果超過17%。

事實上，對于新菌株7-23，和對照菌株5-48相比，搖瓶效價顯著增加，新菌株7-23菌種號從1到10的平均值為255μg/ml、對照菌株5-48菌種號從1到10的平均值為209μg/ml。對于新菌株7-23在18m3發(fā)酵罐放大結(jié)果，和對照菌株5-48相比，新菌株7-23菌種號從1到9的平均值為279μg/ml、對照菌株5-48菌種號從1到9的平均值為238μg/ml。與此同時，所有質(zhì)檢結(jié)果均合格，整個菌株的生產(chǎn)代謝過程較為平穩(wěn)正常，對今后進行實際生產(chǎn)作業(yè)也具有重要意義。

需要注意的是，對于已經(jīng)誘變完成后的菌株，菌落形態(tài)多樣，不同的菌落形態(tài)搖瓶效價也存在明顯差別，在梅花型、饅頭型帶紅邊、草帽型三種菌落形態(tài)中，搖瓶效價最高的則為饅頭型帶紅邊的菌株?，F(xiàn)階段，單菌落進罐則是一種應(yīng)用較為廣泛的菌種類別，無論是搖瓶效價，還是發(fā)酵水平都較為穩(wěn)定。

結(jié)論：綜上所述，對大觀霉素菌種選育的原生質(zhì)體—再生技術(shù)展開分析具有至關(guān)重要的意義。經(jīng)5-48號菌株酶解、誘變處理后的7-23號菌株的搖瓶效價和18m3發(fā)酵罐菌株生產(chǎn)能力都顯著提高。今后，也應(yīng)當(dāng)不斷加強技術(shù)研究，著力形成更具有可行性和規(guī)范性的生產(chǎn)工藝，促使大觀霉素能夠充分發(fā)揮自身應(yīng)用效能。

參考文獻：

[1]王麗霞，孟慶娟，李生龍，等.鹽酸大觀霉素高效液相色譜檢測方法的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（19）：198-202.

[2]丁麗軍，沈建新，陳長寬，等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬肉中大觀霉素和林可霉素殘留量[J].揚州大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2019，40（06）：93-99.