徐芳菲，馮惠柳，李 蕾，初賽君，于 晶，婁子恒，曹志強(qiáng)

（吉林人參研究院·吉林通化·134001）

三七為五加科(Araliaceae) 植物三七Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen 的干燥根和根莖[1]，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材。 三七作為藥用的歷史悠久，在《本草綱目》以前的《醫(yī)門秘旨》、《跌損妙方》中就已有記載，在我國(guó)已有400 多年的栽培歷史，出產(chǎn)于云南、廣西等地[2]。 皂苷是中藥三七的主要化學(xué)成分， 也是大眾公認(rèn)的三七主要活性成分之一。其主要藥理作用為對(duì)血液系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等的影響[2～5]。

黑三七是三七新的加工品，以三七為原料，經(jīng)過(guò)蒸制、干燥加工的黑色或深棕色的產(chǎn)品。 通過(guò)加工炮制，三七中皂苷類成分的結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，主要包括C-20、C-6 和C-3 糖基的水解和糖基水解后C-20 位的脫水反應(yīng)。 使高極性皂苷類成分經(jīng)蒸制后急劇下降，轉(zhuǎn)化為生三七中不存在的低極性皂苷類成分[6]。 研究發(fā)現(xiàn)，黑三七中含有人參皂苷Rg3、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rg5、人參皂苷Rk3、人參皂苷Rk1 等稀有皂苷[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，稀有人參皂苷具有較好抗腫瘤[9-12]、保護(hù)心血管[13-16]、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[17-19]。化學(xué)成分是藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，本文對(duì)黑三七中總皂苷的測(cè)定方法進(jìn)行系統(tǒng)研究，并進(jìn)行多批次樣品的含量測(cè)定， 為黑三七的基礎(chǔ)成分研究提供了參考依據(jù)， 也為黑三七的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜，型號(hào)SP-1920）；電熱恒溫水浴鍋 （金壇市白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠，HH-6）；電子天平（賽多利斯，型號(hào)SQP）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ500-DE ）； 智能高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西，3H16RI）。

1.2 材料

黑三七（吉林人參研究院自制）；人參皂苷Re 標(biāo)準(zhǔn)品( 中國(guó)食品藥品檢定研究院， 批號(hào)110754-201827)；無(wú)水乙醇、甲醇、濃硫酸、苯酚( 北京化工廠，分析純) ；香草醛( 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析純) 。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

稱取人參皂苷Re 對(duì)照品約10mg，精密稱定，加甲醇一定量溶解后定容至10mL 量瓶中，搖勻，即得（濃度為1.05mg/mL）。

2.2 供試品溶液的制備

樣品65℃烘干后，粉碎，過(guò)80 目篩，得樣品粉末。取樣品粉末0.5g，精密稱定，加75%乙醇加熱回流提取3 次，每次10mL，提取時(shí)間2h，合并濾液，蒸干。殘?jiān)蛹状级ㄈ莸?0mL 量瓶中，0.3 加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾（0.45μm），取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.3 溶液的配制

2.3.1 72%硫酸溶液

取硫酸72mL，緩緩注入適量水中，冷卻至室溫，加水稀釋至100mL，搖勻，即得。

2.3.2 8%香草醛乙醇試液

取香草醛0.8g，加無(wú)水乙醇使溶解成10mL，即得。

2.3.3 5%苯酚溶液

取苯酚1g，加入蒸餾水20mL，搖勻，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取人參皂苷Re 對(duì)照品溶液10、20、30、40、60、80、100μL，分別放入帶塞磨口試管中，水浴揮干甲醇，加（2.3.1）5mL，（2.3.2）0.5mL，充分振搖后，置恒溫水浴上60℃加熱10min， 立即使用冰水浴冷卻10～12min，搖勻。采用試劑做空白，按照紫外—可見(jiàn)分光光度法在544nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定其吸光度。 縱坐標(biāo)為吸光度，橫坐標(biāo)為質(zhì)量（μg），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

2.5 總皂苷含量測(cè)定

精密吸取制備的供試品溶液（2.2）10～20μL，放入具塞的刻度試管中， 水浴揮干甲醇后， 加入（2.3.1）5mL，（2.3.2）0.5mL，充分后振搖，置恒溫水浴上60℃加熱10min，立即用冰水浴冷卻10～12min，搖勻。 以試劑做空白，采取紫外-分光光度法于544nm 波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度， 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算待測(cè)樣品中總皂苷的質(zhì)量m。

2.6 總皂苷含量計(jì)算方法

( m 為測(cè)得總皂苷的質(zhì)量，V1為供試品溶液取樣體積，V2為供試品溶液定容體積，M 為樣品質(zhì)量)。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取人參皂苷Re 對(duì)照品溶液30μL，置磨口帶塞試管中，水浴揮干甲醇后，按照（2.5）方法處理后，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄吸光度值。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品分別稱取粉末0.5g （精密稱定）6 份，按照（2.2）方法制備成6 份供試品溶液，按照（2.5）方法進(jìn)行測(cè)定，分別記錄待測(cè)樣吸光度值。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

稱取樣品（已知含量）6 份，每份0.25g，分別加入人參皂苷Re 對(duì)照品溶液5.02（mg/mL）1mL，按照（2.2）方法處理，（2.5）方法進(jìn)行測(cè)定，分別記錄待測(cè)樣吸光度值。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照“2.4” 項(xiàng)下的方法分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。 人參皂苷Re 的回歸方程為y = 0.0046x+0.0076，R= 0.9991。 結(jié)果表明， 總皂苷質(zhì)量在10.62～106.20μg 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，詳見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 精密度試驗(yàn)

連續(xù)6 次測(cè)得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，詳見(jiàn)表1。 結(jié)果表明：精密度試驗(yàn)RSD（n=6）為1.85%，本方法精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

依據(jù)重復(fù)性試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算RSD（n=6）為3.79%，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。 結(jié)果表明：本方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 加樣回收率試驗(yàn)

依據(jù)測(cè)得的檢測(cè)結(jié)果， 計(jì)算回收率為79.10～98.01%、平均回收率為88.74%，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。 結(jié)果表明：本方法準(zhǔn)確度良好。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.5 含量測(cè)定

10 批黑三七中總皂苷含量測(cè)定結(jié)果為5.10%～6.41%，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 10 批黑三七中總皂苷含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

本文采用紫外分光光度法測(cè)定黑三七中總皂苷的含量，該方法易操作、重復(fù)性高。 黑三七是三七新的加工品，皂苷是三七的主要活性成分，三七在炮制黑三七的過(guò)程中皂苷成分會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成次及皂苷。從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，主要特征是母核基本保持不變，發(fā)生的反應(yīng)有脫糖或形成羥基， 脫水生成雙鍵以及C-17 側(cè)鏈的變化等。 此外，本文還對(duì)10 批黑三七進(jìn)行總皂苷的含量測(cè)定，其總皂苷含量均大于5%，結(jié)果表明該加工工藝方法較為穩(wěn)定、可操作性強(qiáng)。本方法的建立可以更好的控制黑三七的產(chǎn)品質(zhì)量， 也為進(jìn)一步規(guī)范黑三七加工規(guī)程提供了有利的評(píng)價(jià)依據(jù)。

本次研究是對(duì)黑三七中總皂苷測(cè)定的初步探索，未對(duì)多年生和多區(qū)域平行樣本加工的黑三七進(jìn)行測(cè)定，而不同地域、不同環(huán)境生長(zhǎng)、不同年生的三七在質(zhì)量、品質(zhì)等方面均有一定的差異，加工黑三七的質(zhì)量也具有一定的差異性，下一步將持續(xù)對(duì)其進(jìn)行深入研究，并繼續(xù)探索其中皂苷類成分的組成以及水解反應(yīng)機(jī)理。 以進(jìn)一步完善和豐富黑三七中有效成分的基礎(chǔ)研究工作，為黑三七的藥理研究、質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。