陶大煒,張小丹,寧喜斌,2,3,4*,孫夢潔

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306) 2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心,上海,201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估試驗室(上海),上海,201306) 4(國家淡水水產(chǎn)品加工技術研發(fā)分中心(上海),上海,201306)

環(huán)糊精通常由6個以上D-吡喃葡萄糖基通過α-1,4-糖苷鍵相連而成,由于葡萄糖基個數(shù)的不同,又被分為α-、β-和γ-環(huán)糊精三種,其中α-環(huán)糊精有6個葡萄糖基,β-環(huán)糊精有7個,而γ-環(huán)糊精有8個[1]。環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase)是一種典型的淀粉分解酶,可對淀粉等物質(zhì)進行降解,使葡萄糖基團發(fā)生轉移,從而獲得環(huán)糊精[2]。環(huán)糊精分子具有的外表親水、內(nèi)里疏水的中空圓筒結構,使得環(huán)糊精可以包絡不同化合物,從而改變它們物理和化學性質(zhì),例如抗氧化、避免熱分解、提高物質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性等,因此環(huán)糊精可以被廣泛地應用于食品工業(yè)、農(nóng)藥、化妝品、醫(yī)藥、環(huán)保、化學分析與檢測等諸多領域里[3-6]。CGTase可廣泛應用于多種反應:環(huán)化、歧化、耦合和水解反應，其中前3種為轉糖基反應，環(huán)糊精由于其高效的轉糖基反應而具有廣闊的工業(yè)運用價值[7-8]。紫外線(ultraviolet,UV)可穿透細菌細胞直接作用于DNA,使得堿基無法正常配對,從而產(chǎn)生基因突變,其具有成本低、操作簡便、高突變率、高安全性等特點[9]。微波作為一種高頻率(300 MHz～3 000 GHz)電磁波,具有設備簡單、操作簡便和安全可靠的誘變特點。微波誘變可通過引起極性分子的劇烈震動,使菌懸液內(nèi)DNA分子間強烈摩擦,細菌DNA結構發(fā)生變化,發(fā)生遺傳變異的可能[10]。

目前國內(nèi)報道的關于此類酶的誘變育種與培養(yǎng)基優(yōu)化等方面,多為物理-化學復合誘變,未見紫外-微波復合誘變方法[11-13]。國內(nèi)外報道的產(chǎn)α-CGTase菌株酶活力較低[14-16]、熱穩(wěn)定性較差[17-19]。本試驗在前期菌株篩選的基礎上,使用紫外-微波復合誘變菌株,研究菌株的最適誘變條件后篩選出酶活力高且遺傳性狀穩(wěn)定的菌株,結合Plackett-Burman試驗及Box-Behnken中心組合試驗2種方法優(yōu)化菌株發(fā)酵條件,旨在高效地提高出發(fā)菌株PaenibacillusmaceransTLLY7的產(chǎn)酶能力,為進一步工業(yè)化開發(fā)利用性狀穩(wěn)定且高產(chǎn)α-CGTase的菌株提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

α-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶產(chǎn)生菌株P.maceransTLLY7,由本實驗室自行篩選鑒定,-80 ℃冰箱甘油管保存[20]。其生理生化特性為可水解淀粉、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、硝酸鹽還原試驗陽性,吲哚試驗、分解酪氨酸試驗陰性等。菌株PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序得到的16S rRNA序列為1 480 bp,經(jīng)構建系統(tǒng)發(fā)育樹后,與P.maceransNBRC 15307T(NR112729.1)在同一分支上,同為類芽孢桿菌屬,結合形態(tài)學、生理生化鑒定確定菌株TLLY7為浸麻類芽孢桿菌(P.macerans),菌株的核酸序列通過Bankit向GenBank申請的登錄號為MT705866。該菌株產(chǎn)酶的酶活力為1.35 U/mL,其最適反應溫度為50 ℃、最適反應pH值為6.0,并且在40～45 ℃、pH 6.0～9.0穩(wěn)定性良好。

1.1.2 試劑

酵母浸粉、可溶性淀粉、蛋白胨等,上海生工生物工程有限公司;α-環(huán)糊精,Sigma(上海)公司;NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、Na2CO3、酚酞、甲基橙及其他試驗所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉10,蛋白胨5,酵母浸粉5,瓊脂15,NaCl 5,Na2CO31,K2HPO4·3H2O 1,MgSO4·7H2O 0.5,酚酞 0.3,甲基橙 1,自然pH,121 ℃,0.1 MPa滅菌20 min。

種子及發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉10,蛋白胨5,酵母浸粉5,NaCl 5,K2HPO4·3H2O 1,MgSO4·7H2O 0.5,pH 7.0,121 ℃,0.1 MPa滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,牛肉膏3,NaCl 5,瓊脂 15,pH 7.0,121 ℃,0.1 MPa滅菌20 min。

1.2 主要儀器與設備

UV-1800PC紫外可見分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;立式高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺,蘇凈集團安泰公司;臺式pH精密測試儀,德國WTW公司;高速臺式離心機,上海安亭科學儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 生長曲線的測定

接種5 mL菌株TLLY7種子液至100 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,在37 ℃,160 r/min下培養(yǎng),每隔4 h取樣,在波長600 nm下測定吸光度,繪制菌株生長曲線。

1.3.2 酶活力測定

制備粗酶液:發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量50 mL/250 mL,菌種接種量為體積分數(shù)4%的種子培養(yǎng)基,37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)48 h,于10 000 r/min離心10 min后所得上清液即為粗酶液。

采用甲基橙褪色法測定酶的環(huán)化活力。在酸性(pH 1.1～1.4)條件下,α-環(huán)糊精與甲基橙發(fā)生反應,形成絡合物,使溶液的吸光度下降。在一定范圍內(nèi),吸光度的下降與α-環(huán)糊精的濃度存在著線性關系[21]。用濃度為50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6.0)配制40 g/L的可溶性淀粉溶液做底物,取0.9 mL于試管中,加入適當稀釋的粗酶液0.1 mL,均勻混合。50 ℃水浴反應10 min,加入濃度為1 mol/L HCl溶液1 mL中止反應。再加入濃度為0.1 mmol/L甲基橙溶液1 mL,于20 ℃靜置15 min,507 nm測定吸光度[22]。對應α-環(huán)糊精標準曲線計算濃度,酶活力單位(U)定義為上述條件下每分鐘生成1 μmol α-環(huán)糊精所需的酶量。

1.3.3 菌懸液的制備

在100 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中接種活化完成的菌株種子液(4%,體積分數(shù))作為發(fā)酵液。取處于對數(shù)生長后期的發(fā)酵液,于10 000 r/min離心10 min,棄上清液收集菌體。用無菌生理鹽水充分振蕩洗滌后,離心2 min棄去上清液,重復2～3次后用生理鹽水重新懸浮菌體,所得即為菌懸液。用顯微鏡進行觀察計數(shù),適當稀釋后使菌液濃度在108CFU/mL左右。

1.3.4 紫外誘變

1.3.4.1 紫外誘變條件的確定

選用的功率為20 W紫外燈,設置其與培養(yǎng)皿間距30 cm。預熱紫外燈30 min后,吸取10 mL菌懸液加入到直徑9 cm的無菌空培養(yǎng)皿中,分別照射10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 s,并用磁力攪拌器攪拌均勻。對紫外誘變后的菌懸液梯度稀釋,吸取100 μL稀釋度為10-4、10-5、10-6的稀釋液至篩選培養(yǎng)基中,涂布均勻,37 ℃避光倒置培養(yǎng)48 h,進行菌落計數(shù)[9]。挑選出長勢良好的單菌落,發(fā)酵培養(yǎng)并分別測定酶活力,計算正突變率。取未經(jīng)誘變處理的等濃度菌懸液作為對照組,對致死率進行計算。根據(jù)致死率和正突變率確定紫外誘變的最佳時間。按公式(1)(2)計算致死率和正突變率:

(1)

(2)

1.3.4.2 紫外誘變選育高酶活力菌株

對菌株TLLY7在最佳的紫外誘變條件下進行誘變,并測定平板中長勢良好的菌株酶活力,得到酶活力較高的菌株做進一步研究。

1.3.5 微波誘變

1.3.5.1 微波誘變條件的確定

選用額定功率為700 W,脈沖頻率為2 450 MHz的微波爐。吸取1 mL菌懸液至2 mL離心管中,將離心管放在盛有蒸餾水的燒杯中,每隔15 s換1次水,以減少微波的熱效應造成菌懸液溫度過高而導致菌體大量死亡。使用低火檔,輻照時間依次為15、30、45、60、75、90 s,并對微波誘變后的菌懸液梯度稀釋,吸取100 μL稀釋度為10-4、10-5、10-6的稀釋液至篩選培養(yǎng)基中,涂布均勻,37 ℃避光倒置培養(yǎng)48 h,進行菌落計數(shù)[10]。挑選出長勢良好的單菌落,發(fā)酵培養(yǎng)并分別測定酶活力,計算正突變率。取未經(jīng)誘變處理的等濃度菌懸液作為對照組,計算致死率。根據(jù)致死率和正突變率確定微波誘變的最佳時間。

1.3.5.2 微波誘變選育高酶活力菌株

對經(jīng)紫外誘變后得到的高酶活力菌株UV2-10在最佳微波誘變條件下進行誘變,并對平板中長勢良好的菌株進行酶活力測定,得到酶活力較高的菌株做進一步研究。

1.3.6 突變菌株遺傳穩(wěn)定性的測定

對經(jīng)復合誘變處理后選取的高酶活力菌株UM2-6連續(xù)傳代8次培養(yǎng),每代菌株均測酶活力,考察其遺傳的穩(wěn)定性。

1.3.7 復合誘變菌株產(chǎn)α-CGTase條件的優(yōu)化

在前期單因素試驗的基礎上,對復合誘變菌株UM2-6的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化,通過Plackett-Burman(PB)試驗對顯著因素進行篩選,再中心組合Box-Behnken(BBD)設計響應面試驗,以獲得最優(yōu)產(chǎn)酶條件。

1.3.7.1 PB試驗設計

選取影響產(chǎn)酶的9個因素進行考察,分別為可溶性淀粉含量、酵母浸粉含量、培養(yǎng)溫度、初始pH、NaCl含量、接種量、CaCl2含量、裝液量、K2HPO4·3H2O含量,以酶活力(Y)為響應值,進行PB試驗設計(N=12),記低水平為-1,高水平為+1。此外K為虛擬因素,用來考察實驗誤差。PB試驗設計的因素與水平見表1。

1.3.7.2 響應面試驗設計

利用PB設計試驗篩選出的3個顯著性因素,即培養(yǎng)溫度(A)、初始pH(B)、接種量(C),采用BBD中心組合設計,以A、B、C為自變量,以酶活力(Y)為響應值設計3因素3水平試驗。中心組合試驗方案中的因素及水平見表2,使用Design-Expert 8.0.6進行分析處理數(shù)據(jù)。

表1 Plackett-Burman設計變量Table 1 Process variables used in Plackett-Burman design

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 菌株TLLY7的生長曲線

圖1為菌株的生長曲線。從培養(yǎng)8 h開始,菌株TLLY7的菌體數(shù)快速增長,并在24 h后逐漸緩慢增長并趨于穩(wěn)定,40 h后菌體逐漸走向衰亡。

圖1 菌株TLLY7的生長曲線Fig.1 The growth curve of strain TLLY7

2.2 α-環(huán)糊精的標準曲線

根據(jù)標準方法繪制α-環(huán)糊精標準曲線。擬合線性回歸方程:y=0.546 1x-0.000 8,R2=0.999 1,表明線性良好。

2.3 物理誘變

2.3.1 紫外誘變的致死率和正突變率

圖2反映了紫外誘變時間與菌株致死率和正突變率的關系。菌株致死率隨著紫外線照射時間的延長而逐漸升高,當紫外線照射時間為100 s時,紫外誘變菌株致死率接近100%。在0～70 s時,菌株正突變率隨著紫外線照射時間的延長也在不斷升高。當紫外線照射時長為70 s時,菌株正突變率最高,為21.42%,此時菌株致死率為80.95%。近年來許多學者的研究表明,正向突變的菌株較多出現(xiàn)在致死率為80%左右,結合致死率和正突變率曲線,確立菌株TLLY7的紫外誘變的最佳時間為70 s,這與前人研究中的致死率選擇相近[23-24]。

2.3.2 紫外誘變選育高酶活力菌株

對菌株TLLY7進行紫外誘變后,得到共計56株誘變菌株。挑選出長勢較好的菌株19株進行發(fā)酵復篩,得到高酶活力誘變菌株UV2-10,菌株酶活力由初始的1.35 U/mL提高到2.27 U/mL。表3為部分紫外誘變菌株的酶活力測量值。

圖2 紫外誘變的致死率和正突變率Fig.2 Lethal rate and positive mutation rate of ultraviolet mutagenesis

表3 紫外誘變菌株的篩選結果Table 3 Screening results of ultraviolet mutagenesis strains

2.3.3 微波誘變的致死率和正突變率

圖3反映了微波誘變時間與菌株致死率和正突變率的關系。菌株致死率隨著微波輻照時間延長而逐漸升高,當微波輻照時間為105 s,致死率為100%。在0～60 s時,菌株正突變率隨著微波輻照時間的延長也在不斷升高,當微波誘變時間為60 s,致死率為77.36%,此時正突變最高,為23.61%。結合致死率和正突變率曲線,確立最佳微波誘變時間為60 s。

2.3.4 微波誘變選育高酶力菌株

對菌株UV2-10進行微波誘變后,得到共計72株誘變菌株。挑選出長勢較好的菌株31株進行發(fā)酵復篩,得到高酶活力復合誘變菌株UM2-6,酶活力由2.27 U/mL提高到3.09 U/mL。表4為部分微波誘變菌株的酶活測量值。

圖3 微波誘變的致死率和正突變率Fig.3 Lethal rate and positive mutation rate of microwave mutagenesis

表4 微波誘變菌株的篩選結果Table 4 Screening results of microwave mutagenesis strains

2.3.5 復合誘變菌株UM2-6遺傳穩(wěn)定性的測定

對復合誘變菌株UM2-6進行連續(xù)傳代8次,測定各代菌株產(chǎn)α-CGTase酶活力,結果見表5。復合誘變菌株UM2-6產(chǎn)酶活力比較穩(wěn)定,沒有顯著變化,說明遺傳性能穩(wěn)定,具有進一步研究的價值。

表5 突變株UM2-6各代產(chǎn)α-CGTase活力Table 5 α-CGTase activity produced by mutant UM2-6 of every generation

2.4 突變菌株UM2-6產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.4.1 PB試驗設計與顯著性因素篩選結果

前期通過單因素試驗已分析出9個影響菌株產(chǎn)酶的因素,分別為可溶性淀粉含量、酵母浸粉含量、培養(yǎng)溫度、初始pH、NaCl含量、接種量、CaCl2含量、裝液量、K2HPO4·3H2O含量。在此基礎上,對這9個因素進行PB試驗設計(N=12),以考察各因素對菌株產(chǎn)酶能力的影響,并篩選顯著性影響因素,對試驗設計結果進行主效應分析,結果見表6。篩選出的顯著因素分別為培養(yǎng)溫度、初始pH、接種量,P值分別為0.033、0.034、0.045,均小于0.05。

表6 Plackett-Burman設計的各因素水平及主效應分析Table 6 Factors,levels and significance analysis of Plackett-Burman design

2.4.2 響應面設計與結果分析

2.4.2.1 BBD試驗設計結果與回歸模型的方差分析

以培養(yǎng)溫度(A)、初始pH(B)、接種量(C)為考察因素,響應值為酶活力(Y),設計響應面試驗,并對試驗結果的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到模型的二次回歸方程:

Y=4.11+0.031A+0.31B-0.081C+0.015AB+0.027AC+0.040BC-0.45A2-0.22B2-0.84C2

式中:Y,α-CGTase的預測酶活力(U/mL);A、B、C,分別代表培養(yǎng)溫度(℃)、初始pH、接種量(%)。

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

2.4.2.2 響應面曲線及等高線分析

圖4為通過Design-Expert軟件分析出3種顯著性影響因素的響應面曲線和等高線。

圖4 培養(yǎng)溫度、初始pH、接種量交互作用對酶活力影響的響應面曲線及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between temperature,initial pH and inoculum on enzyme activity

各因素的響應面曲線皆呈拋物線形狀,且開口向下,表明存在響應最大值。等高線的形狀與響應面曲線的陡緩程度可反應因素交互作用的強弱,響應面曲線越陡,因素間的交互作用就越顯著;響應面曲線越平滑,因素間的交互作用越小。若等高線呈橢圓形,表明因素間的交互作用較顯著;等高線呈圓形,表明因素間交互作用不顯著[25-26]。則根據(jù)圖4的結果,說明B和C交互作用顯著,A和B、A和C交互作用不顯著。

2.4.3 驗證實驗

利用Design-Expert 8.0.6分析得到影響α-CGTase酶活力的最佳條件理論值為培養(yǎng)溫度37.13 ℃,初始pH 6.85,接種量3.97%,理論最高酶活力為4.22 U/mL?？紤]到實際操作,調(diào)整最佳條件為培養(yǎng)溫度37.1 ℃,初始pH 6.9,接種量4.0%,測得α-CGTase酶活力為4.19 U/mL,證實了響應模型的有效性,說明經(jīng)優(yōu)化所得的最佳條件可信。優(yōu)化前的發(fā)酵條件為:可溶性淀粉10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度37 ℃、接種量4%、裝液量50 mL/250 mL,突變菌株UM2-6產(chǎn)α-CGTase的酶活力為3.09 U/mL,優(yōu)化之后的酶活力為優(yōu)化之前的1.36倍,氮源、金屬離子及其他條件的改變有效地提升了該菌株的產(chǎn)酶能力。

3 結論與討論

本研究對α-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶產(chǎn)生菌株P.maceransTLLY7進行了紫外-微波復合誘變,并對所得復合誘變菌株UM2-6的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,顯著提高菌株產(chǎn)酶水平。確定了紫外、微波復合誘變的最佳誘變條件,其中紫外誘變的最佳誘變條件為:紫外線照射70 s,致死率為80.95%,此時菌株正突變率最高,為21.42%,經(jīng)過篩選后得到酶活力最高的菌株UV2-10,酶活力為2.27 U/mL;微波誘變的最佳誘變條件為:低火檔輻照60 s,致死率為77.36%,此時菌株正突變最高,為23.61%,將紫外誘變所得菌株UV2-10進行微波誘變處理,經(jīng)過篩選后得到復合誘變菌株UM2-6,其酶活力為3.09 U/mL。在前期單因素試驗的基礎上,通過PB試驗設計篩選出培養(yǎng)溫度、初始pH、接種量3個顯著因素,再用BBD試驗確定最佳發(fā)酵條件。結果表明,最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為可溶性淀粉10 g/L、酵母浸粉10 g/L、NaCl 2 g/L、CaCl20.2 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L,最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度37.1 ℃、初始pH 6.9、接種量4%。在此優(yōu)化條件下,突變菌株UM2-6產(chǎn)α-CGTase的酶活力為4.19 U/mL,為優(yōu)化之前酶活力(3.09 U/mL)的1.36倍。

陳龍然[16]通過紫外-硫酸二乙酯復合誘變地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis),再通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化誘變株產(chǎn)α-CGTase的發(fā)酵條件,其酶活力達2.28 U/mL,是出發(fā)菌株(0.95 U/mL)的2.4倍。雷新輝等[27]通過紫外-亞硝酸復合誘變產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca),誘變株產(chǎn)α-CGTase酶活力達3.76 U/mL,是出發(fā)菌株(0.62 U/mL)的5.06倍。上述研究中，發(fā)酵優(yōu)化后的菌株酶活力均不及本研究中經(jīng)復合誘變和產(chǎn)酶條件優(yōu)化后所得菌株酶活力。陳龍軍等[12]利用基因工程技術將嗜熱芽胞桿菌(Gebacilliussp.)異源表達后，利用單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵條件，其產(chǎn)α-CGTase酶活達5.3 U/mL，是野生菌(0.66 U/mL)的8倍。本研究的野生菌株的酶活力高于此研究中野生菌株的酶活，但是突變菌株低于其經(jīng)產(chǎn)酶基因異源表達后基因工程菌的酶活力。為進一步提高酶活力,仍需要通過對菌株產(chǎn)酶基因進行克隆表達或?qū)δ康幕蚱芜M行蛋白質(zhì)工程改良等基因工程技術,而篩選出酶活力高、性質(zhì)優(yōu)良的出發(fā)菌株是這些方法的基礎。本研究為實驗室后期提高酶活力等試驗奠定了基礎,為工業(yè)生產(chǎn)α-CGTase及應用提供了參考。