李堯,盧承蓉,劉丹,韓翔鵬,鐘青萍

(華南農(nóng)業(yè)大學 食品學院,廣東 廣州,510642)

多糖是由糖苷鍵連接,由10個以上單糖組成的高分子碳水化合物[1]。其結(jié)構(gòu)復雜,種類繁多,在調(diào)節(jié)細胞生命活動過程中起著重要作用,與核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)一起被稱為生命體的四大基礎物質(zhì)[2]。乳酸菌是公認安全(generally recognized as safe,GRAS)的微生物[3],所產(chǎn)胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)也被認為是安全無害的。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長和代謝過程中分泌到細胞外的多糖類化合物,可分為黏液多糖和莢膜多糖[4],兩者結(jié)構(gòu)相似,但莢膜多糖與細胞結(jié)合緊密,通過簡單離心不能分離,通常所說的胞外多糖多為黏液多糖。根據(jù)結(jié)構(gòu)和組成的不同,可分為同多糖(homopolysaccharide,HoPS)和雜多糖 (heteropolysaccharide,HePS)。同多糖的合成通常是在細胞外進行的,其組成簡單,一般只由一種單糖組成;雜多糖的合成主要在細胞質(zhì)中進行,其組成成分比較復雜,由不同種類的單糖或者單糖衍生物組成[5]。大多數(shù)乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖都是HePS,與HoPS相比,其結(jié)構(gòu)復雜,包含不同比例的單糖,如鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等,有時還會出現(xiàn)糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺和一些非碳水化合物取代基如乙酸鹽、丙酮酸等,它們可能對胞外多糖的益生功能起到關(guān)鍵作用[6]。

不同來源乳酸菌的胞外多糖有多種健康功效,如益生元的作用、調(diào)節(jié)免疫功能、抗氧化、抗腫瘤和降膽固醇等[7]。有關(guān)植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)等的胞外多糖的研究報道較多,對乳酸片球菌胞外多糖的研究較為少見,且大多集中研究益生效果,對其一級結(jié)構(gòu)或者高級結(jié)構(gòu)影響其益生特性的機制研究較少。本文對益生功能較好的1株乳酸片球菌C6菌株所產(chǎn)的胞外多糖進行分離純化,分析其單糖組成,并進行了紅外光譜測定和核磁共振分析,探討胞外多糖結(jié)構(gòu)與其抗氧化性能的關(guān)系,為乳酸菌胞外多糖作為天然抗氧化劑的研究和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高產(chǎn)胞外多糖的乳酸片球菌C6菌株,由本實驗室分離鑒定和保藏。

DEAE-Sepharose Fast Flow、Sepharose CL-6B、透析袋、Tris,北京索萊寶科技有限公司;硫酸、苯酚, 廣州化學試劑廠;巖藻糖(fucose,Fuc)、鼠李糖(rhamnose,Rha)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)、鹽酸氨基葡萄糖(glucosamine hydrochloride,Gah)、半乳糖(galactose,Gal)、葡萄糖(glucose,Glc)、N-乙酰-D-氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine,NAG)、木糖(xylose,Xyl)、甘露糖(mannose,Man)、果糖(fructose,Fru)、核糖(ribose,Rib)、3-脫氧-D-甘露-2-辛酮糖酸(3-deoxy-D-manno-oct-2-ulsonic acid,Kdo)、半乳糖醛酸(galacturonic acid,GalA)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA),上海源葉生物科技有限公司;焦性沒食子酸,天津市北辰方正試劑廠;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[ 2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid),ABTS],美國Sigma公司。

MRS培養(yǎng)基:無水葡萄糖20.0 g/L,胰蛋白胨10.0 g/L,牛肉膏5.0 g/L,酵母粉4.0 g/L,吐溫-80 1.0 mL/L,無水乙酸鈉5.0 g/L,檸檬酸三銨 2.0 g/L,K2HPO4·3H2O 2.0 g/L,結(jié)晶MgSO40.2 g/L,MnSO4·H2O 0.05 g/L。終pH為6.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

ABTS工作液:將ABTS溶液(7.4 mmol/L)與等體積K2S2O8溶液(2.6 mmol/L)充分混合,置于黑暗條件下靜置12 h后放入冰箱保存?zhèn)溆?。每次使用前用PBS溶液(pH 7.4)稀釋,使其OD734 nm為(0.7±0.02)。

1.2 儀器與設備

ESCO ClassⅡ生物安全柜,新加坡藝思高科技有限公司;ALPHA 2-4 LDplus冷凍干燥機,德國CHRIST公司;Avanti J-E落地式高速大容量離心機,美國Beckman Coulter公司;HH-4恒溫水浴鍋,常州智博瑞儀器制造有限公司;VersaMax光柵型酶標儀,美國Melecular Devices公司;1525高效液相色譜儀,美國Waters公司;ICS5000離子色譜儀,美國Thermo Fisher公司;Avance III HD核磁共振波譜儀,瑞士Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸片球菌EPS的提取

參考盧承蓉等[8]的方法并略作修改。將菌株按3%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h,連續(xù)活化3次后于10 000 r/min離心10 min(4 ℃),棄去培養(yǎng)液中的菌體,取上清液并加入800 g/L三氯乙酸溶液,使溶液中三氯乙酸終質(zhì)量濃度為4 g/L,在4 ℃冰箱中靜置6～8 h后于10 000 r/min離心15 min(4 ℃),棄去蛋白質(zhì)沉淀,取上清液,加入自身3倍體積預冷的乙醇(體積分數(shù)95%),在4 ℃冰箱中靜置12～15 h后于10 000 r/min離心15 min(4 ℃),取多糖沉淀并加入去離子水溶解后移至透析袋中,截留分子質(zhì)量8 k～14 kDa,用去離子水透析3 h后第1次換水,之后每隔8 h換1次水,持續(xù)2 d,收集透析液后進行真空冷凍干燥,即得到粗多糖。

1.3.2 乳酸片球菌EPS的分離純化

1.3.2.1 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析

Tris-HCl溶液平衡DEAE-Sepharose Fast Flow(2.6 cm×58 cm)離子交換層析柱過夜,0.1 g粗多糖溶于5 mL Tris-HCl溶液中,0.45 μm濾頭過濾后上樣,以含不同濃度NaCl(0、0.1、0.3、0.5、0.7 mol/L)的Tris-HCl溶液作為洗脫液,流速1 mL/min進行梯度洗脫,每8 mL收集1管,以硫酸-苯酚法[9]檢測多糖含量,測定其OD490 nm。以管數(shù)為橫坐標,OD490 nm為縱坐標,作洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線收集每一個單一峰,在減壓條件下濃縮,用去離子水透析2 d,真空冷凍干燥。

1.3.2.2 Sepharose CL-6B 分子篩層析

Tris-HCl溶液平衡Sepharose CL-6B(2.6 cm×60 cm)層析柱過夜,取經(jīng)離子交換層析后的多糖樣品0.1 g溶于1 mL Tris-HCl溶液中,0.45 μm濾頭過濾后上樣,以Tris-HCl溶液作為洗脫液,流速0.5 mL/min進行洗脫,每8 mL收集1管,硫酸-苯酚檢測多糖含量,測定其OD490 nm。以管數(shù)為橫坐標,OD490 nm為縱坐標,作洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線收集每一個單一峰,在減壓條件下濃縮,用去離子水透析2 d,真空冷凍干燥。

1.3.3 乳酸片球菌EPS純化組分的抗氧化活性

1.3.3.1 對DPPH自由基的清除能力

At:1 mL 8.0 mg/mL EPS溶液與1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液;Ar:1 mL 8.0 mg/mL EPS溶液與1 mL無水乙醇;A0:1 mL無水乙醇與1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液。配制A0、At、Ar這3種溶液,分別充分混勻后在常溫黑暗條件下靜置30 min,測其OD517 nm。按公式(1)計算DPPH自由基的清除率:

(1)

式中:At、Ar、A0分別為相應溶液的吸光度(下同)。

1.3.3.2 對ABTS陽離子自由基的清除能力

At:60 μL 8.0 mg/mL EPS溶液與3.0 mL ABTS工作液;Ar:60 μL 8.0 mg/mL EPS溶液與3.0 mL K2S2O8溶液;A0:60 μL去離子水與3.0 mL ABTS工作液。配制A0、At、Ar這3種溶液,分別充分混勻后置于30 ℃的恒溫水浴鍋中反應5 min,測其OD734 nm。按公式(2)計算ABTS陽離子自由基的清除率:

(2)

1.3.3.3 對·OH的清除能力

At:1 mL 8.0 mg/mL EPS溶液、1 mL 9.0 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇與1 mL 8.8 mmol/L H2O2;Ar:將At中H2O2溶液替換成去離子水;A0:將At中EPS溶液替換成去離子水。配制A0、At、Ar這3種溶液,分別充分混勻后置于37 ℃的恒溫水浴鍋中反應30 min,測其OD510 nm。按公式(3)計算·OH的清除率:

(3)

(4)

1.3.4 乳酸片球菌EPS純化組分的結(jié)構(gòu)分析

1.3.4.1 相對分子質(zhì)量測定

純化后EPS的相對分子質(zhì)量(Mw)測定采用凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography,GPC)進行測定。取0.5 mg的樣品溶解于1 mL超純水中,0.22 μm濾膜過濾后進行GPC檢測。采用不同相對分子質(zhì)量的標準葡聚糖制作標準曲線,以保留時間為橫坐標,lgMw為縱坐標。

GPC條件:采用PL aquqgel-OH MI×ED(250 mm×4.6 mm,8 μm)色譜柱,2414示差折光檢測器,以0.2 mol/L NaNO3、0.01 mol/L NaH2PO4(pH 7)為流動相;柱溫30 ℃;進樣量10 μL;流速1 mL/min進行洗脫。

1.3.4.2 單糖組成分析

EPS單糖定性分析:通過對比樣品與單糖標準品的出峰時間來確定EPS純化組分的單糖組成。取各樣品4 mg于安瓿瓶中,加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸,120 ℃水解3 h。準確吸取200 μL酸水解溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中氮吹吹干,加入1 mL水渦旋混勻,12 000 r/min離心5 min后取上清液,采用離子色譜儀分析。

分析條件:采用Dionex CarbopacTMPA20色譜柱(3 mm×150 mm);電化學檢測器;進樣量5 μL;以A:H2O,B:250 mmol/L NaOH,C:50 mmol/L NaOH和500 mmol/L 乙酸鈉作為流動相,進行三元梯度洗脫;柱溫30 ℃;流速0.3 mL/min。

1.3.4.3 紅外光譜測定

取2 mg EPS和200 mg KBr充分混合研磨均勻,壓片機壓片,以空白KBr為空白,調(diào)整基線,扣除背景干擾,透射模式測定,掃描次數(shù)為32,紅外光譜分辨率為4 cm-1,4 000～400 cm-1掃描。

1.3.4.4 核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)分析

取5 mg EPS中加入0.5 mL重水,超聲至完全溶解后,于500 MHz Bruker Avance III HD型核磁共振波譜儀進行分析,以四甲基硅烷為內(nèi)標,室溫測定EPS的1H NMR、13C NMR。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸片球菌EPS的分離純化

2.1.1 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析純化EPS

經(jīng)粗提的EPS為混合多糖,含有其他雜質(zhì),需對其進一步分離純化。DEAE-Sepharose Fast Flow是一種弱陰離子交換介質(zhì),適用于中性多糖、酸性多糖的分離[10]。圖1所示,粗EPS經(jīng)不同濃度的Tris-NaCl洗脫后共得到5個多糖組分,將其中3個含量較多的組分分別命名為EPS1、EPS2、EPS3。

圖1 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析純化EPSFig.1 DEAE-Sepharose Fast Flow ion exchange chromatography of EPS

EPS1由Tris-HCl洗脫得到,可知EPS1不帶電荷,為中性多糖;EPS2、EPS3分別由含NaCl濃度為0.1、0.3 mol/L 的Tris-HCl洗脫得到,因此這2個組分帶負電荷,可知它們?yōu)樗嵝远嗵腔蚝兴嵝曰鶊F的糖類復合物[11]。

2.1.2 Sepharose CL-6B分子篩層析純化EPS

經(jīng)離子交換層析后可得到電荷性質(zhì)相近的多糖組分,但其分子質(zhì)量可能不同,因此還需進行下一步分離純化。瓊脂糖凝膠CL-6B的排阻極限為1×104～4×106Da,適用于多糖組分的進一步分離純化。由圖2可知,3個多糖純化組分經(jīng)分子篩層析后,EPS2、EPS3得到比較對稱的單一尖銳峰,由此可知EPS2和EPS3均為分子質(zhì)量大小均一的單一組分。

圖2 EPS1、EPS2、EPS3的Sepharose CL-6B分子篩層析Fig.2 Sepharose CL-6B molecular exclusion chromatography for EPS1,EPS2,EPS3

2.2 乳酸片球菌EPS純化組分的抗氧化活性分析

圖3 EPS純化組分的抗氧化活性測定Fig.3 Antioxidant activities of the EPSs

2.3 乳酸片球菌EPS的結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 EPS純化組分的相對分子質(zhì)量測定

使用GPC測定EPS的相對分子質(zhì)量。用不同相對分子質(zhì)量的標準葡聚糖來制作標準曲線,得到回歸方程y=-1.061 7x+12.896 8,R2=0.993 1。EPS2、EPS3的保留時間分別為8.116 7、8.000 0 min,代入標準曲線方程,計算得到其分子質(zhì)量分別為1.90×104、2.53×104Da。

乳酸菌EPS的分子質(zhì)量通常在1×104～4×106Da[12],EPS的分子質(zhì)量、糖苷鍵構(gòu)型對物理活性及益生功能有著重要影響。分子質(zhì)量較低的EPS具備更好的水溶性及相對更加舒展的糖鏈構(gòu)象,從而具備更好的生物活性[13]。

2.3.2 EPS純化組分的單糖組成分析

采用14種單糖為標準品,以離子色譜儀分析EPS純化組分的單糖組成,結(jié)果如圖4所示,2.18 min及40.45 min處分別為NaOH及乙酸鈉的峰;EPS2主要由木糖組成,另有少量的鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖,其摩爾比為0.912∶0.016∶0.022∶0.051;EPS3則由鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸組成,其摩爾比為0.105∶0.231∶0.471∶0.170∶ 0.010∶0.013。

乳酸菌的EPS多為HePS,其單糖成分多為葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖等[14],其中葡萄糖與半乳糖為乳酸菌EPS中最常見的單糖,這可能與培養(yǎng)基的成分有關(guān)[15]。本文中乳酸片球菌C6的EPS2單糖組分主要為木糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖及葡萄糖,而EPS3的單糖組分主要為鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸,其中半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸為乳酸菌EPS中常見單糖組分。LIU等[16]分析1株植物乳桿菌的EPS,發(fā)現(xiàn)其主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸及葡萄糖組成;WANG等[17]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌KX041在MRS肉湯培養(yǎng)基中產(chǎn)生的EPS由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成。而鹽酸氨基葡萄糖在乳酸菌EPS單糖組分中則少見報道,這種組分目前可以用來預防和治療關(guān)節(jié)炎,對EPS3益生功能的多樣性有待進一步研究。EPS的抗氧化能力與糖醛酸的含量相關(guān)[18],EPS3的抗氧化能力強于EPS2可能是因為其含有半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸成分。

a-單糖標準品,b-EPS2,c-EPS3圖4 單糖標準品及EPS的離子色譜圖Fig.4 Ion chromatogram of monosaccharide standards and EPSs

2.3.3 EPS純化組分的紅外光譜分析

對純化EPS進行紅外光譜掃描,探究其主要官能團組成,結(jié)果如圖5所示。

a-EPS2;b-EPS3圖5 EPSs的紅外光譜掃描圖Fig.5 Infrared spectrum scan of EPSs

2.3.4 EPS純化組分的NMR分析

2.3.4.1 EPS純化組分的1H NMR分析

EPS的1H NMR可分為3個區(qū)域:δ4.5～5.5 信號為異頭質(zhì)子區(qū),δ3.1～4.5 為環(huán)質(zhì)子區(qū)域,對應于C2～C6連接的質(zhì)子,δ1.2～2.4 為烷基區(qū)[25-26]。EPS在1H NMR中的質(zhì)子信號范圍很窄,且存在耦合和裂分,因此無法確認所有質(zhì)子的化學位移,一般α-吡喃糖的異頭氫質(zhì)子信號δ>4.95,而β-吡喃糖的異頭氫質(zhì)子信號δ<4.95,因而1H NMR的譜圖主要用于確認EPS的糖苷鍵構(gòu)型。

圖6分別為EPS2、EPS3的1H NMR譜圖,5.4處無信號,表明所有糖殘基均屬于吡喃糖,與紅外光譜保持一致。4.80、4.79 處的強峰為重水產(chǎn)生的吸收峰,此外EPS2、EPS3在4.5～5.5 分別出現(xiàn)6、7種異頭氫質(zhì)子信號,其信號分別為5.31、5.15、5.13、5.10、5.05、4.91 及5.46、5.42、5.31、5.23、4.67、4.66、4.52,2種EPS組分中糖苷鍵構(gòu)型均含有α構(gòu)型、β構(gòu)型。1H NMR的環(huán)質(zhì)子區(qū)域(3.1～4.5)信號堆疊,證實了EPS結(jié)構(gòu)復雜,有研究表明D-葡萄糖羰基氫在3.53 處為三重態(tài)(t),在3.57和3.75 處具有雙-雙態(tài)(dd)信號,在3.92和3.96 處為雙重dubletos(dl)[27]。HePS中通常會同時存在α和β構(gòu)型,EPS的構(gòu)型對其益生功能起重要作用,LI等[28]研究中,β構(gòu)型糖苷鍵的EPS具有更強的抗癌作用,此外,與α-(1→4)鍵相比,具β-(1→4)鍵EPS溶液的黏性更大[6]。

a-EPS2-b-EPS3圖6 EPSs的1H NMR譜圖Fig.6 1H NMR spectrum of EPSs

2.3.4.2 EPS純化組分的13C NMR分析

EPS的13C NMR譜圖包括異頭碳區(qū)域(95～110)、環(huán)碳區(qū)域(50～85)[29]。在13C NMR光譜中,δ95～101的峰主要是由于α-異頭碳引起的,而δ101～105主要歸因于β-異頭碳[30],所以13C NMR光譜主要用來確定EPS的糖苷鍵類型及構(gòu)型。

圖7分別為EPS2、EPS3的13C NMR譜圖。2種EPS的異頭碳區(qū)域分別有7、6種異頭碳信號,分別為102.19、102.01、100.78、100.54、98.22、98.08及109.20、108.54、106.62、103.04、102.78、101.14、95.29,表明EPS2、EPS3分別含有7、6種糖殘基,2種EPS均含有α-異頭碳、β-異頭碳,與1H NMR的結(jié)果一致。EPS2在160～180處沒有信號,表明其不含糖醛酸,而EPS3在160～180處的低信號表明其含有糖醛酸,這與單糖組成分析結(jié)果一致。2種EPS在90處均無明顯信號,表明其不含呋喃環(huán)構(gòu)型[31]。

a-EPS2;b-EPS3圖7 EPSs的13C NMR譜圖Fig.7 13C NMR spectrum of EPSs

3 結(jié)論