羅小娟 蔡德豐 任振敏 劉永秋 劉 景 黃麗蘭 劉小蘭 曹 科 陳運生

急性呼吸道感染(ARTI)是 5 歲以下兒童的主要死因之一。早期明確病原，有助于臨床采取針對性治療，減少抗生素不合理應用[1]。然而，ARTI病原復雜多樣，不同病原所致臨床表現(xiàn)缺乏特異性，且不同地域和氣候特征條件下ARTI病原可能存在不同的流行特征，加上病毒易變異和新型病毒的出現(xiàn)，導致ARTI的病因診斷較為困難[2-4]。深圳市具有亞熱帶季風氣候特點，也是中國最大的移民城市，ARTI病原學可能具有獨特的流行特征。此外，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)流行暴發(fā)以來，ARTI的病原流行特征和病原譜可能發(fā)生了重要變化。本研究旨在了解深圳市兒童常見呼吸道病原體的感染情況和流行特征，并比較 COVID-19疫情前后病原譜的變化，為本地區(qū)ARTI的臨床診治及防控提供參考。

1 方法

1.1 納入標準 2019年9月2日至2021年2月28日深圳市兒童醫(yī)院(我院)因臨床診斷ARTI(診斷標準參照文獻[5])住院首次采集并送檢的咽拭子標本、年齡29 d至18歲的患兒。

需要說明的是，同一患兒多次因ARTI住院的，每次入院首次采集的咽拭子標本均納入分析。

1.2 排除標準 ①根據(jù)入院臨床診斷，排除先天性遺傳病、免疫缺陷病、惡性腫瘤等；②排除本次住院期間接受了放化療或免疫抑制劑治療。

1.3 分組考慮 ①以2020年3月至2021年2月的數(shù)據(jù)進行不同季節(jié)的ARTI病原譜比較，春季為3～5月，夏季為～8月，秋季為～11月，冬季為12月至次年2月。②按患兒年齡分為29 d至6月組、～1歲組、～3歲組、～6歲組、～18歲組。③以2019年9月2日至2020年1月24日的數(shù)據(jù)作為COVID-19疫情前組、2020年9月2日至2021年1月24日的數(shù)據(jù)作為疫情后組。

1.4 咽拭子樣本采集 患兒在入院當天采集咽拭子。由我院經(jīng)過護理部統(tǒng)一培訓并考核合格的護士，使用專用的植絨拭子(意大利科潘恩股份公司，國械注進20172410211)，左手用壓舌板壓住患兒舌頭，右手將拭子伸至咽峽處，適度用力擦拭咽后壁或懸雍垂的后側和兩側扁桃體部位并旋轉拭子3圈以增加接觸面，避免接觸舌和口腔黏膜等處，取樣后迅速將拭子放入裝有3 mL細胞保存液(寧波海爾施基因科技有限公司，浙甬食藥監(jiān)械生產(chǎn)備20150063號)的采樣管中，靠近采樣管頂端處折斷拭子并棄去尾部，旋緊管蓋，2 h內送達實驗室，保存于-20℃冰箱，24 h內完成檢測。

1.5 病原學檢測 采用核酸提取試劑盒(寧波海爾施基因科技有限公司，浙甬械備20150246號)和13種呼吸道病原體多重檢測試劑盒(寧波海爾施基因科技有限公司，浙食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20130074號)，經(jīng)全自動核酸提取儀Smart LabAssist-32磁珠法提取病原體總核酸。通過多重PCR與毛細電泳聯(lián)用技術，用針對13種常見呼吸道病原體核酸序列特異區(qū)域的熒光標記引物，在1個擴增管中進行多重反轉錄和聚合酶鏈反應，擴增產(chǎn)物在3500 Dx自動測序儀上進行毛細電泳，經(jīng)Gene Mapper(ABI Prism)分析擴增片段的大小和峰高，得到相應病原體的檢測結果。嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行操作。試劑盒帶有RT-PCR內參，可對樣本核酸提取、RT-PCR和毛細管電泳進行全程質量監(jiān)控。通過對RNA和DNA中的人類管家基因進行PCR擴增，進行樣品質量監(jiān)控，如PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細電泳可見人RNA、DNA內參峰，說明采樣質量合格。同時設立陽性對照(13種病原體檢測靶點和人RNA、DNA的重組質粒)和陰性(人基因組溶液)對照。

13種常見呼吸道病原體檢測項目包括：甲型流感病毒(IVA，含H7N9、H1N1、H3N2、H5N2)、季節(jié)性H3N2病毒、甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒(IVB，含Victoria株和Yamagata株)、副流感病毒(HPIV，含1型、2型、3型和4型)、呼吸道合胞病毒(RSV，含A組和B組)、腺病毒(HADV，含B組、C組和E組)、鼻病毒(HRV)、偏肺病毒(HMPV)、冠狀病毒(HCOV，含229E、OC43、NL63和HKU1)、博卡病毒(Boca)、肺炎支原體(MP)和衣原體(Ch，含沙眼衣原體和肺炎衣原體)。

同時檢出≥2種病原體為混合感染。

1.6 資料截取 由1名檢驗技師和1名臨床醫(yī)師分別從我院檢驗信息系統(tǒng)(LIS)和管理信息系統(tǒng)(HIS)中以月為單位導出患兒姓名、性別、年齡、臨床診斷、采樣時間和病原體檢測結果，由第3人復核2個系統(tǒng)導出數(shù)據(jù)的一致性，如有月份數(shù)據(jù)不一致，則重新導出并再次核對。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，病原體檢出率等計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 研究期間我院共12 734例因臨床診斷ARTI而送檢的咽拭子樣本，其中新生兒89份，先天性遺傳病、免疫缺陷病、惡性腫瘤患兒271例，接受放化療或免疫抑制劑治療156例，ARTI患兒在住院期間非首次采樣的咽拭子標本196例。最終12 022例咽拭子標本進入本文分析，男7 226例，女4 796例，年齡29 d至17歲11月齡，平均(2.8±3.0)歲。

2.2 13種ARTI病原檢出情況 12 022例ARTI住院患兒病原體陽性7 589例(63.13%)，檢出率由高到低依次是：HRV 24.83%(2 985例)、 RSV 14.12%(1 698例)、HPIV 8.33%(1 001例)、HMPV 7.01%(843例)、MP 5.37%(645例)、HADV 4.26%(512例)、Boca 2.94%(353例)、HCOV 2.70%(325例)、IVA 2.33%(280例)、H3N2 1.50%(180例)、Ch 0.93%(112例)、H1N1 0.47%(56例)、IVB 0.18%(22例)。

混合感染1 329例(11.05%)，其中同時檢出2種病原體陽性1 238例(10.29%)、2種病原體陽性88例(0.74%)、4種病原體陽性3例(0.02%)，以HRV+MP最常見，具體見表1。

表1 1 329例混合感染的ARTI患兒咽拭子標本的病原體分布

2.3 不同季節(jié)的ARTI病原譜比較 2020年3月至2021年2月共 8 357例ARTI患兒咽拭子標本進入分析，不同季節(jié)的檢出率由高到低依次為：秋季66.94%(1 924/2 874)、冬季66.44%(2 029/3 054)、夏季56.88%(918/1 614)、春季16.20%(132/815)。春、夏、秋、冬季混合感染檢出率分別為0.74%(6例)、3.41%(55例)、8.18%(235例)和2.39%(73例)。IVA在春季和夏季各檢出1例，IVB僅在夏季檢出1例，H1N1和H3N2在全年均未檢出，圖1顯示，其余9種病原體在不同季節(jié)的檢出率差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.001)。春季檢出率最高的病原體為HRV和MP，夏季和秋季均為RSV和HRV，冬季為HRV和HMPV。

2.4 不同性別、不同年齡ARTI患兒的病原譜比較 男患兒病原體檢出率為63.58%(4 594/7 226)，女患兒為62.41%(2 993/4 796)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.69，P=0.19)。 RSV和Boca在男患兒中檢出率分別為15.00%和3.31%，明顯高于女患兒的12.80%和2.38%(χ2=11.49，P<0.001；χ2=8.76，P<0.001)，HMPV在女患兒中的檢出率(7.86%)明顯高于男患兒的6.45%(χ2=8.81，P<0.001)。

圖1 不同季節(jié)ARTI病原體檢出率比較

29 d至6月組、～1歲組、～3歲組、～6歲組和～18歲組病原體檢出率分別為60.11% (1 269/2 111)、66.31% (1 104/1 665)、67.73% (2 485/3 669)、68.20% (2 003/2 937)、41.65% (683/1 640)， 差異有統(tǒng)計學意義(χ2=1 036.88，P<0.05)；混合感染檢出率分別為11.32%(239例)、8.59%(143例)、12.24%(449例)、13.55%(398例)和6.16%(101例)。圖2顯示，隨年齡增長，RSV和HPIV檢出率呈明顯下降趨勢，MP檢出率呈上升趨勢。除HCOV、H1N1和IVB外，其他10種病原體在不同年齡患兒中的檢出率差異均有統(tǒng)計學意義。

圖2 不同年齡ARTI患兒的病原體檢出情況

2.5 COVID-19疫情前后同時段病原譜比較 圖3顯示，COVID-19疫情前病原體檢出率為78.57%(2 592/3 299)，由高到低依次為HRV(36.37%)、MP(15.40%)、RSV(10.03%)、HADV(9.03%)等，混合感染764例(23.16%)。疫情后同期病原體檢出率為65.89%(3 500/5 312)，由高到低依次為HRV(23.78%)、RSV(14.74%)、HMPV(12.65%)、HPIV(12.12%)等，混合感染459例(8.64%)。COVID-19疫情前后同期比較，除HCOV以外，其余12種病原體的檢出率差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 COVID-19疫情前后同時段病原譜比較

3 討論

病原學診斷是ARTI診治的關鍵，然而，據(jù)報道25%～60%病例難以明確病原[6]。針對ARTI常見呼吸道病原進行多重、聯(lián)合和高通量檢測，對早期明確病原體及合理用藥具有積極意義。本研究采用多重PCR與毛細電泳聯(lián)用技術，檢測ARTI住院患兒咽拭子標本中13種常見的呼吸道感染病原體，結果顯示，深圳地區(qū)ARTI住院患兒ARTI病原以HRV、RSV、HPIV、HMPV、MP和HADV最常見，與2015年《新英格蘭醫(yī)學雜志》[7]報道的兒童肺炎病原體(按檢出率高低依次為：RSV、HRV、HMPV、HADV、MP、HPIV)結果相似，與國內研究[8-13]報道的ARTI病原譜存在一定差異，可能與檢測時間和地域不同、檢測方法和納入檢測的病原體種類不同，以及納入研究對象存在差異(門診或住院病例、年齡、呼吸道感染部位)有關。

本研究中深圳市兒童ARTI的病原特征如下：①總體檢出率較高(63.13%)，2019年秋季檢出率達80.87%，高于文獻[8，11～14]中ARTI患兒病原體檢出率(10.64%～60.35%) ，低于文獻[9,10]下呼吸道感染住院患兒病原體檢出率(分別為78.7%和80.1%)，可能與這2篇文獻中檢測的病原體種類較多(分別為18和22種)有關。此外，相比傳統(tǒng)的病原分離培養(yǎng)方法和血清免疫學抗體檢測，多重PCR技術敏感度、特異度、通量高，覆蓋廣，效率高，對ARTI病原診斷和混合感染的檢測具有優(yōu)勢。②存在明顯的季節(jié)和年齡分布特點，冬、春季是呼吸道感染的高發(fā)季節(jié)，但本地區(qū)ARTI病原體檢出率卻為秋季最高(67.01%)，春季最低(16.20%)，且2020年3月至2012年2月僅檢出2例(2/8 357)IVA，未檢出H1N1和H3N2，與上年度(2019年9月至2020年2月)檢出IVA 278例(7.59%)、H1N1 56例(1.53%)、H3N2 180例(4.92%)比較，這些病原體檢出率呈急劇下降。北京地區(qū)董靜肖等[15]對門診發(fā)熱伴呼吸道癥狀患兒的病原分析同樣顯示，IVA檢出率在COVID-19爆發(fā)流行后顯著下降。一方面，可能與IVA的自然流行趨勢和病毒變異有關。另一方面，可能與2020年初爆發(fā)COVID-19，患兒減少到醫(yī)院就診以及人群普遍采取嚴格的防控措施有關。本研究中夏、秋季檢出率以RSV為首，HRV次之；冬季HMPV檢出率最高；春季以HRV、MP檢出為主，與國內其他地區(qū)報道[16,17]不同，可能與深圳市夏季高溫多雨、冬季陰冷潮濕的亞熱帶季風氣候有關。

本研究中6月至6歲患兒病原體檢出率均高于總體人群。隨著年齡增長，RSV和HPIV檢出率明顯下降，MP檢出率明顯升高，與國內其他研究[18,19]報道一致。雖然隨著年齡增長，病毒檢出率有所下降，但HRV和HMPV在>6歲兒童中檢出率仍較高，應引起重視。

混合感染較多見，同時檢出≥2種病原體1 329例(11.05%)，以HRV+MP、HRV+RSV、HRV+HPIV常見。HRV是小RNA病毒科腸道病毒屬，在無明顯呼吸道感染癥狀的兒童中檢出率明顯高于RSV和HADV，單獨感染時癥狀輕微，不增加兒童住院風險[20]，提示其是條件致病微生物，在原發(fā)性感染導致機體免疫力下降時易繼發(fā)感染。因此，混合感染是存在條件致病微生物的定植還是感染，需綜合判斷。有研究表明，RSV合并其他病原感染可加重病情并增加治療難度，可能與免疫炎癥反應的正反饋效應導致細胞因子和炎癥介質釋放增加，加重小氣道黏膜充血水腫，使分泌物增加，進而導致氣道狹窄和氧交換障礙有關[21]。

本研究顯示COVID-19疫情后ARTI住院患兒病原體總體檢出率和混合感染率較疫情前同期明顯下降，提示采取佩戴口罩、減少人員聚集、做好個人防護等防疫措施，以及全民公共衛(wèi)生素養(yǎng)提高，可有效降低ARTI疾病傳播和流行。疫情前后ARTI病原譜發(fā)生明顯改變，疫情前組以HRV、MP、RSV、HADV和IVA為主。疫情后組以HRV、RSV、HMPV、HPIV和Boca為主。COVID-19流行期間ARTI病原流行特征變化包括：①MP和IVA檢出率顯著減少；②往年秋冬季高發(fā)的RSV感染提前在7～10月出現(xiàn)；③新型病毒如HMPV和Boca檢出率增加。相關研究表明，HMPV和Boca感染臨床癥狀明顯，可導致支氣管炎、毛細支氣管炎，也可引起重癥肺炎，在兒童社區(qū)獲得性肺炎中檢出率為4.1%～11.5%[22]，提示人類感染性疾病愈發(fā)復雜，防控工作任重道遠。

本研究局限性：①研究對象為ARTI住院患兒，未納入門診輕癥患兒；②檢測病原體為13種呼吸道感染常見的病毒和非典型病原體，未檢測其他引起呼吸道感染的病原體，如肺炎鏈球菌、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌等細菌，真菌，寄生蟲，對新發(fā)未知病原體和罕見病原體亦無法檢出。