隗志松，舒園園，蔡得田，劉育華，王慶飛，王 群，馬雪寒

（武漢多倍體生物科技有限公司，武漢 430300）

水稻（Oryza sativaL.）是一種重要的糧食作物，世界上大概50%以上人口以大米為主食，如中國、印度、巴基斯坦等［1］。多倍體水稻的研究國際上可以追溯至1937年［2］，中國的多倍體水稻育種研究由鮑文奎先生于1953年開創(chuàng)［3］。多倍體水稻育種是不同于二倍體水稻育種的一種新型育種途徑，多倍體植物對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，抗旱、抗寒等優(yōu)勢明顯，僅從地理分布上看，多倍體大多出現(xiàn)在環(huán)境變化劇烈的地區(qū)，說明多倍體植物能夠更好地適應(yīng)不利自然條件［4-6］。雖然一些相關(guān)研究取得了進(jìn)展，但是多倍體水稻結(jié)實率低的問題仍沒有得到實質(zhì)性突破。多倍體水稻具備增產(chǎn)潛力大和抗逆性強(qiáng)的優(yōu)勢，但結(jié)實率低一直制約著其發(fā)展。因多倍化伴隨著基因劑量的成倍增加，減數(shù)分裂的控制機(jī)制變得異常復(fù)雜，導(dǎo)致水稻花粉發(fā)育模式和種子早期發(fā)育的改變，絕大多數(shù)多倍體水稻花粉嚴(yán)重敗育且結(jié)實率低，制約多倍體水稻育種研究的發(fā)展進(jìn)程。多倍體水稻關(guān)鍵種質(zhì)減數(shù)分裂穩(wěn)定品系PMeS的成功選育為多倍體水稻育種提供了種質(zhì)，同時也突破了多倍體水稻低結(jié)實的瓶頸［7］。

蔡得田教授與袁隆平院士、盧興桂研究員得益于自然界的重要啟示，共同提出了“利用遠(yuǎn)緣雜交和多倍體雙重優(yōu)勢選育超級稻”的新思路［4］。該育種思路與常規(guī)育種相比具備遠(yuǎn)緣雜種和多倍體雜種的雙重優(yōu)勢，理論上可以帶來產(chǎn)量的大幅增加。多倍體水稻關(guān)鍵種質(zhì)減數(shù)分裂穩(wěn)定品系PMeS的成功選育是多倍體水稻育種過程中的重要突破，為多倍體水稻育種提供了關(guān)鍵種質(zhì)。但目前，關(guān)于其高結(jié)實機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步深入開展，解析關(guān)鍵種質(zhì)PMeS的高結(jié)實特性，選育優(yōu)良的高結(jié)實多倍體水稻品系，并將其運用于育種實踐是使多倍體水稻造福于人類的根本性育種策略。

多倍體水稻育種經(jīng)過多年的科研積累已經(jīng)取得了一系列的成果，如湖北省重大科技成果（EK040192）和十余項發(fā)明專利。水稻遠(yuǎn)緣雜交和多倍化后染色體數(shù)目成倍增加，遺傳背景復(fù)雜且基因重組類型多，性狀穩(wěn)定慢，育種年限拉長，因此迫切需要利用現(xiàn)代細(xì)胞工程、基因工程等技術(shù)的協(xié)同攻關(guān)［8，9］。智能育種工廠可以模擬大自然環(huán)境，縮短水稻的基本營養(yǎng)生長時間，使其快速進(jìn)入生殖生長階段，在室內(nèi)進(jìn)行全生育期的加代快繁，改變目前包括南繁在內(nèi)的一年只能繁殖兩代的育種現(xiàn)狀。在智能育種工廠里能實現(xiàn)從種子到種子，每年可實現(xiàn)3～4代的快速繁殖，縮短育種周期；并在單倍體快速加代穩(wěn)定的同時，結(jié)合基因芯片進(jìn)行基因檢測、靶向定位、高通量分子標(biāo)記等高科技育種輔助手段，在智能育種工廠里淘汰含不良性狀的單株，保留含優(yōu)良性狀的單株移栽到大田進(jìn)行擴(kuò)繁和鑒定，最終選育出符合育種目標(biāo)的品種。

為了加快多倍體水稻的育種進(jìn)程，武漢多倍體生物科技有限公司于2019年初新建了多倍體水稻全生育期智能育種工廠（PGBS），承建單位為武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司，并于同年6月正式投入使用。經(jīng)近2年的使用，育種工廠主要作用于加代快繁、組織培養(yǎng)、抗性改良等幾個方面。多倍體水稻育種不同于二倍體水稻，四倍體水稻有四套染色體組，因其遺傳與分離的復(fù)雜性，需要長時間才能穩(wěn)定。在自然條件下一年兩代的繁殖速度遠(yuǎn)不能滿足多倍體水稻的育種需求，而在智能育種工廠里一年3～4代的繁殖速度加快了多倍體水稻的育種進(jìn)程；優(yōu)異種質(zhì)資源是多倍體水稻育種的基礎(chǔ)，在利用組培技術(shù)創(chuàng)制多倍體水稻種質(zhì)資源過程中倍性檢測是必不可少的重要環(huán)節(jié)，利用智能育種工廠進(jìn)行多倍體水稻的形態(tài)學(xué)檢測可免受氣候及區(qū)域的限制；另外，在多倍體水稻材料的雜交改良、分子輔助選擇育種以及四倍體恢復(fù)二倍體水稻的培養(yǎng)中智能育種工廠都有重要作用。多倍體水稻全生育期智能育種工廠的合理應(yīng)用勢必加快多倍體水稻的育種進(jìn)程。

1 智能育種工廠的基礎(chǔ)設(shè)備

智能育種工廠的LED燈光可以對光譜進(jìn)行精準(zhǔn)的控制，模擬自然光。依據(jù)三色調(diào)色原理，通過LED光源陣列進(jìn)行不同光譜的混合，模擬出不同的光譜，滿足不同植物的生長需求。智能育種工廠的LED植物光照系統(tǒng)的光照度可以達(dá)到1 800μmol/（m2·s）（光量子通量密度），能夠滿足幾乎所有植物生長的需求［夏季光照度一般為1 800μmol/（m2·s）左右，中午為2 550μmol/（m2·s）左右］。LED燈光屬于冷光源，其釋放的熱量比高壓鈉燈少很多，可以在很小的空間范圍內(nèi)實現(xiàn)溫度的精準(zhǔn)控制。LED燈光使用壽命長，光衰慢，使用5年都不需要更換，且光強(qiáng)幾乎不會減弱。

智能育種工廠可以實現(xiàn)精準(zhǔn)的環(huán)境控制：智能育種工廠通過中央控制系統(tǒng)對環(huán)境做到精準(zhǔn)控制；控制器通過采集傳感器信號和設(shè)定值進(jìn)行比對，通過PID+PWM輸出自動調(diào)節(jié)加熱功率或制冷劑流量，使設(shè)備箱內(nèi)的空氣溫濕度達(dá)到動態(tài)平衡；可以按照用戶的需求設(shè)計溫度和濕度的控制范圍，溫度控制精度為±1℃，濕度控制精度為±5%～8%（RH）。采用暗藏式空氣處理機(jī)組，設(shè)計采用管道分區(qū)域定點送回風(fēng)方式，可以保證各區(qū)域的溫濕度同時達(dá)到所設(shè)定參數(shù)，并且升降溫過程平穩(wěn)，無明顯過沖現(xiàn)象。模擬自然界溫濕度變化，氣流分布均勻，溫濕度場合理。新風(fēng)和循環(huán)風(fēng)同時并行，既保證足量的新風(fēng)和CO2濃度，又可以循環(huán)利用，節(jié)約能源。智能控制系統(tǒng)有溫濕度、光照等參數(shù)實時數(shù)據(jù)顯示功能，為了保證歷史數(shù)據(jù)安全性，該系統(tǒng)具有歷史數(shù)據(jù)儲存功能，同時能通過USB接口將歷史數(shù)據(jù)導(dǎo)出，可保存半年的相關(guān)試驗數(shù)據(jù)，便于追溯和重復(fù)。

目前，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、中國科技大學(xué)以及航天登月工程中，利用智能育種工廠在密封的空間培育出各種蔬菜。研究者可以利用智能育種工廠輔助選育出符合生產(chǎn)應(yīng)用的優(yōu)良水稻品種進(jìn)行推廣，為農(nóng)民和國家增收、增益。

2 智能育種工廠在多倍體水稻加代快繁中的應(yīng)用

在二倍體水稻的育種過程中，需要5～8代的系統(tǒng)選育，選育品種才會趨于穩(wěn)定［10，11］。四倍體水稻有四套染色體，因其遺傳與分離的復(fù)雜性，其難以像二倍體水稻那樣經(jīng)過幾年的加代即可基本穩(wěn)定，往往需要種植幾十代才能穩(wěn)定［12］。受自然條件限制，在湖北省農(nóng)作物每年只能種植一代，多倍體水稻新品種的選育周期長，南繁即使一年兩代的種植對于多倍體水稻的育種進(jìn)程來說都是緩慢的，全生育期水稻智能育種工廠的建設(shè)正好解決了該問題［13］。智能育種工廠通過對光譜、光照度、光照時長、溫度、濕度、CO2濃度的調(diào)節(jié)，從而能縮短水稻的整個生長周期。

2.1 智能育種工廠二倍體和四倍體水稻全生育期比較

2.1.1 試驗材料 試驗品種（品系）：二倍體秈稻有豐兩優(yōu)四號、野香優(yōu)莉絲、Y兩優(yōu)多回14；二倍體粳稻有南粳46、龍粳31、RBD-1；四倍體秈稻有A3、T7、17HD391；四倍體秈稻有DBT01、DBT02、DBT03。

2.1.2 試驗方法

1）自播種開始前20 d為長日照處理。光照處理12 h，溫度32℃，濕度70%，CO2濃度450 cm2/m3；暗處理12 h，溫度27℃，濕度50%，CO2濃度350 cm2/m3。

2）第21天至成熟為短日照處理。光照處理10 h，溫度32℃，濕度60%，CO2濃度450 cm2/m3；暗處理14 h，溫度27℃，濕度40%，CO2濃度350 cm2/m3。

3）播種后一個月施肥一次。試驗所使用的為32孔穴盤，每穴盤施10 g水溶肥。水溶肥的成分及含量為N 20%、P 10%、K 20%、Cu 0.05%、Zn 0.1%、Fe 0.1%、Mn 0.1%。全生育過程保證穴盤不缺水。

2.1.3 結(jié)果與分析 表1為水稻品種（品系）在智能育種工廠與田間種植的全生育期比較。從表1可以看出，在智能育種工廠里種植的水稻全生育期相對于田間種植都有明顯縮短，縮短幅度在1.4%～38.0%；如果按照智能育種工廠中的水稻全生育期計算，理論上可以實現(xiàn)一年3～4代的快繁體系建設(shè)，而且粳稻的效果好于秈稻。

表1 水稻品種（品系）在智能育種工廠與田間種植的全生育期比較

2.2 智能育種工廠在多倍體水稻組織培養(yǎng)中的應(yīng)用

2.2.1 形態(tài)學(xué)倍性鑒定 多倍體水稻種質(zhì)資源的創(chuàng)制是多倍體水稻育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，而倍性的鑒定在多倍體水稻新型種質(zhì)資源的創(chuàng)制中是一個必不可少的環(huán)節(jié)。二倍體水稻經(jīng)過誘導(dǎo)愈傷、加倍培養(yǎng)、恢復(fù)培養(yǎng)、分化出苗、生根等一系列的試驗過程創(chuàng)制出的組培苗是否被成功誘導(dǎo)為四倍體水稻，倍性的鑒定是關(guān)鍵一步。當(dāng)季節(jié)不適宜水稻的生長時，可以將組培苗移栽至智能育種工廠里進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定，并收獲加倍成功的多倍體水稻種子。圖1為編號2020wzm組培加倍苗在智能育種工廠里的形態(tài)鑒定情況。二倍體水稻在組培加倍后得到的同源（亞同源）四倍體水稻結(jié)實率降低、子粒增大、有芒，植株較二倍體更高、莖稈更粗、分蘗降低、株形松散。

圖1 2020wzm組培加倍苗形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.2 花藥組織培養(yǎng) 利用水稻花藥培養(yǎng)可以實現(xiàn)單倍體育種，也可以嘗試?yán)们锼伤貎纱渭颖兜姆椒焖俚玫郊兒系乃谋扼w水稻［14］。水稻的花藥培養(yǎng)，取材是關(guān)鍵，既要保持花藥新鮮，又要取材時期恰當(dāng)。武漢市當(dāng)?shù)匾荒暌患镜乃痉N植限制了花藥組織培養(yǎng)的試驗進(jìn)程。在智能育種工廠內(nèi)可以實現(xiàn)一年3～4次的試驗取材，且取材方便，加快了試驗進(jìn)度。圖2為從智能育種工廠取材的花藥組培。

2.2.3 雜種胚挽救 雜交是常用的一種水稻育種手段，水稻有很多雜種因胚乳未發(fā)育完全以至需要胚挽救；利用普通的浸種方法難以出苗，四倍體水稻雜種更是如此，利用組織培養(yǎng)進(jìn)行胚挽救可以很好地解決這一問題。因水稻的雜種有很多褶皺的部分，在組培中很難消毒徹底，這時會存在染菌風(fēng)險，長出的幼苗一但染菌必須及時處理，這時只有一種方法就是殺菌后進(jìn)行移栽。胚挽救的苗因內(nèi)生菌的問題導(dǎo)致移栽的苗一般都很弱小，移栽到田間很難做到精細(xì)化管理，而在智能育種工廠中則可以進(jìn)行精細(xì)化的水肥管理，待苗長茁壯后再移至田間，增加胚挽救苗的成活率；若自然條件不適宜時也可直接在智能育種工廠里種植至成熟。

圖3 胚挽救苗

2.3 智能育種工廠在多倍體水稻抗性改良中的應(yīng)用

現(xiàn)有多倍體水稻種質(zhì)有限，尤其在抗性、品質(zhì)等方面的優(yōu)異資源匱乏，已嚴(yán)重影響了多倍體水稻育種的進(jìn)一步發(fā)展，所以急需大力創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)、抗病的多倍體水稻種質(zhì)資源［15］。2019—2020年利用組培技術(shù)結(jié)合武漢雙綠源創(chuàng)芯科技研究院有限公司的GSR40K水稻高密度全基因組SNP芯片在智能育種工廠里創(chuàng)制并改良了含稻瘟病抗性基因的高結(jié)實四倍體水稻株系。圖4為含稻瘟病抗性基因的高結(jié)實率四倍體改良過程，其中2次苗期取葉片進(jìn)行稻瘟病抗性篩選的過程均在育種工廠內(nèi)進(jìn)行，篩選后將含有抗性基因的幼苗移至大田進(jìn)行選種；雜交試驗也在智能育種工廠中完成。

圖4 含稻瘟病抗性基因的高結(jié)實率四倍體改良過程

表2為稻瘟病抗性基因的篩選結(jié)果。從表2中可以看出，SYY1、SYY2、SYY3、SYY4、SYY5、SYY6、SYY7、SYY9、SYY10均含有Pia抗性位點；在Xa21抗性位點上，其核心區(qū)域的基因型和代表品種一致，核心區(qū)域下游35 kb范圍內(nèi)發(fā)生了重組，其抗性有待進(jìn)一步驗證；SYY8含有Pia及Pi d 3抗性位點；SYY143-1、SYY143-2含有Pi2、Pi5及Xa21抗性位點；SYY416-1、SYY416-2含有Pi2、Pi 5、Pia及Pi t a抗性位點，在X a21抗性位點上，其核心區(qū)域的基因型和代表品種一致，核心區(qū)域下游60 kb范圍內(nèi)發(fā)生了重組，其抗性有待進(jìn)一步驗證。

表2 利用基因芯片進(jìn)行稻瘟病抗性基因的篩選結(jié)果

3 小結(jié)

自育種工廠建成投入使用至今，進(jìn)行了大量試驗，結(jié)果表明，在全生育期智能育種工廠內(nèi)可實現(xiàn)一年3～4代的從種子到種子水稻加代快繁體系建設(shè)；可以正確地進(jìn)行多倍體水稻加倍苗的倍性形態(tài)學(xué)鑒定；可以一年反復(fù)多次進(jìn)行水稻幼穗和花藥組培試驗取材工作；可以在育種工廠內(nèi)實現(xiàn)雜交育種，并大大增加胚挽救苗成活率；可以輔助完成優(yōu)質(zhì)、高抗的高結(jié)實四倍體水稻新材料的創(chuàng)制及改良工作等。多倍體水稻全生育期智能育種工廠的建設(shè)可以加快多倍體水稻的育種進(jìn)程。