唐芬芬，楊偉克，謝 昆，袁盛勇，沈登榮，何 超，張 睿，劉 娜

（1. 紅河學(xué)院 生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，云南 蒙自 661101；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101）

海藻糖酶（Trehalase，EC3.2.1.28）廣泛存在于細菌、真菌和動植物體內(nèi)。海藻糖酶是昆蟲機體唯一能夠水解海藻糖的酶類，它可專一地將海藻糖水解為葡萄糖，參與機體的能量代謝過程，維持正常的生理活動[1?2]。利用海藻糖酶抑制劑Trehazolin 抑制東亞飛蝗機體海藻糖酶活性，幼蟲活動能力減弱，取食減少，糖代謝進程受阻[3?4]。在低溫或短光照條件下，海藻糖酶活性的增強能促進家蠶滯育激素的釋放，進而誘導(dǎo)雌性蛾子卵巢產(chǎn)滯育卵[5]。海藻糖酶在昆蟲滯育過程受到保幼激素和蛻皮激素協(xié)同調(diào)控，并參與滯育期機體的物質(zhì)能量代謝過程[5?6]。注射蛻皮激素20E 能誘導(dǎo)甜菜夜蛾海藻糖酶基因SeTre1的表達，增強海藻糖酶活性[6]。喂食20E能提高竹長蠢幼蟲中腸海藻糖酶活性和促進其編碼基因的表達[7]。研究表明，昆蟲海藻糖酶在殺蟲劑的解毒代謝過程以及昆蟲抗逆性的適應(yīng)過程中也發(fā)揮了一定的作用[8?9]。三唑磷農(nóng)藥處理褐飛虱幼蟲，機體海藻糖酶基因Tre1顯著上調(diào)表達，海藻糖酶活性呈現(xiàn)先逐漸增強后急劇減弱的趨勢，暗示海藻糖參與了褐飛虱抵抗三唑磷農(nóng)藥的解毒過程[10]。嗜眠搖蚊幼蟲通過降低海藻糖酶活性，減少海藻糖的水解，使海藻糖大量累積，用于應(yīng)對干旱等不良環(huán)境的脅迫[11]。

海藻糖酶作為家蠶機體極其重要的一類水解酶，在蛻皮變態(tài)過程中通過調(diào)控表皮幾丁質(zhì)的合成和降解，進而影響蠶體的生長發(fā)育[12]。海藻糖酶直接影響蠶體海藻糖的代謝進程，其活性大小與蠶體的生理狀況及抗逆性密切相關(guān)[13]。一般情況下，蠶體海藻糖酶活性強，機體糖代謝旺盛，幼蟲的生長發(fā)育齊一，蛻皮變態(tài)進程順利，自身抗性也隨著增強。家蠶核型多角體病毒（BmNPV）感染在家蠶飼育過程中較常見，主要誘發(fā)家蠶血液型膿病。該病傳染性強，危害嚴(yán)重，每年給蠶農(nóng)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[14]。關(guān)于家蠶抗BmNPV的研究[15?16]雖然已有許多報道，但BmNPV 與宿主的相互作用機制至今仍未完全解析清楚[17?18]。海藻糖酶作為機體抗逆性的一類糖水解酶，不僅能將海藻糖水解為小分子的葡萄糖，為蠶體提供能量物質(zhì)，而且在機體抗逆過程發(fā)揮了重要功能。然而，關(guān)于海藻糖酶在家蠶抵御BmNPV 侵染過程中的生理作用及其分子機制的研究鮮見報道。鑒于此，以具有經(jīng)濟價值的絹絲昆蟲家蠶為研究對象，探究其在遭受BmNPV 侵染后，海藻糖酶活性及其編碼基因表達變化規(guī)律，以期為闡明BmNPV 對宿主家蠶的侵染機制和培育強健性多絲量家蠶新品種提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試家蠶品種為菁松，飼育條件為26 ℃、相對濕度(75±5)%，新鮮桑葉飼養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 培養(yǎng)箱和HSW24 型電熱恒溫水浴鍋購自廣州深華生物技術(shù)有限公司；實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司；ThermoFisher 高速冷凍離心機、Bio Tek Synergy 多功能酶標(biāo)儀和ThermoFisher 雙光束紫外/可見分光光度計購自昆明伯騰儀器有限公司。

1.2.2 主要試劑 動物組織總RNA 抽提試劑盒購自O(shè)mega 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司；實時熒光定量PCR試劑（FastStart SYBR Green Master）購自上海翊圣生物科技有限公司；海藻糖、PBS緩沖液（pH 值為5.8）和3，5-二硝基水楊酸購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 添食病毒及樣品采集 參照唐芬芬等[18]報道的方法，選取生長發(fā)育良好、大小一致的家蠶幼蟲，從五齡起喂食BmNPV，每頭家蠶經(jīng)口喂食10 μL 的病毒懸液（含量為4.85×108個/mL），同時以喂食等體積的滅菌水為對照組（CK），隨后在相同條件下用新鮮桑葉飼育。喂食BmNPV后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h和48 h，冰上解剖家蠶幼蟲，取血淋巴、中腸和脂肪體，對照組同時取材。每次取樣均設(shè)3 次重復(fù)，每個重復(fù)取5 頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶液的制備 分別取1.0 g 的中腸和脂肪體組織，置于玻璃勻漿器中，加入2 mL 預(yù)冷的PBS緩沖液（pH 值為5.8），在冰上充分研磨。然后將勻漿液轉(zhuǎn)移至5 mL 離心管中，在4 ℃條件下，12 000 r/min 離心10 min，取上清液作為待測酶液。取800 μL 血淋巴，加入1.2 mL 預(yù)冷的PBS 緩沖液（pH 值為5.8），12 000 r/min 離心15 min，棄沉淀取上清液，即為待測酶液。

1.3.3 海藻糖酶活性測定 在5 mL 離心管中，加0.2 mL 的 待 測 酶 液、2 mL 的PBS 緩 沖 液（pH 值5.8）和3%的海藻糖溶液0.5 mL，混勻，室溫靜置10 min，在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)50 min，然后加入1 mL 的3，5-二硝基水楊酸終止反應(yīng)，最后在沸水中煮沸5 min。冷卻至室溫，取適量反應(yīng)液，用紫外分光光度計測定其在550 nm 處的吸光值。以等量的PBS 緩沖液（pH 值5.8）為對照。

1.3.4 總RNA 的提取和cDNA 的制備 按照Omega 公司動物組織總RNA 提取試劑盒操作說明，抽提家蠶血淋巴、中腸和脂肪體總RNA，利用紫外分光光度計測定RNA 的濃度，根據(jù)TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.5 實時熒光定量PCR 以家蠶核糖體蛋白基因（BmRpL3）為內(nèi)參基因，海藻糖酶（BmTre）基因為靶標(biāo)基因，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計實時熒光定量PCR 引物（序列見表1）。實時熒光定量PCR 參 照FastStart SYBR Green Master 試 劑 盒 操 作說明進行。 反應(yīng)體系20 μL，設(shè)定程序：95 ℃30 s →（95 ℃5 s→60 ℃30 s）40 個 循環(huán)→65 ℃5 s（然后每次加0.5 ℃，直到95 ℃5 s）。Bio-Rad 公司CFX-96 實時熒光定量PCR 檢測儀記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)公式2-ΔΔCT計算基因的相對表達量[19]。

表1 實時熒光定量PCR引物Tab.1 Primers used in quantitative real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016 和SPSS 21.0 對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmNPV對家蠶不同組織BmTre表達水平的影響

經(jīng)口喂食BmNPV 后，家蠶血淋巴、脂肪體和中腸海藻糖酶基因BmTre的相對表達量變化情況如圖1 所示。將對照組各個時間點BmTre的相對表達量設(shè)定為1，喂食BmNPV 組BmTre的相對表達量若大于1，表明基因上調(diào)表達，反之則下調(diào)表達。

由圖1 可知，喂食BmNPV 后3 h，血淋巴BmTre的相對表達量無顯著變化；在6 h、9 h和12 h，BmTre持續(xù)上調(diào)表達，相對表達量分別是對照組的2.5 倍、2.9 倍和2.6 倍；而在24 h 和48 h，BmTre的表達受到抑制，呈下調(diào)表達趨勢。脂肪體BmTre 基因在9 h開始上調(diào)表達，12 h時表達量最高，24 h表達量有減弱的趨勢，但仍高于對照組；在48 h，BmTre的相對表達量降至最低值，僅為對照組的35%。中腸BmTre 在喂食BmNPV 后3 h 就開始上調(diào)表達，相對表達量逐漸增加，在9 h 時表達量最高，隨后在12 h時BmTre表達量開始急劇減弱，在48 h 表達量降至最低，約為對照組的13%。

2.2 BmNPV對家蠶血淋巴海藻糖酶活性的影響

如圖2 所示，血淋巴海藻糖酶活性在喂食BmNPV 后6 h 開始顯著增加（P＜0.05），9 h 和12 h酶活性持續(xù)高于對照組，分別是對照組的2.2 倍和1.9 倍，并且差異達到極顯著水平（P＜0.01）；24 h 酶活性開始急劇降低，48 h 酶活性降至最低，僅為對照組的23%，差異達到極顯著水平（P＜0.01）。

2.3 BmNPV對家蠶脂肪體海藻糖酶活性的影響

由圖3 結(jié)果可知，喂食BmNPV 后3 h 和6 h，家蠶脂肪體海藻糖酶活性與對照組相比無顯著差異。在9 h 酶活性開始增加，且顯著高于對照組（P＜0.05）；12 h 和24 h 酶活性均高于對照組，差異達到極顯著水平（P＜0.01）；而在感染48 h酶活性極顯著低于對照組（P＜0.01）。整體呈現(xiàn)先逐漸升高后急劇降低的趨勢。

2.4 BmNPV對家蠶中腸海藻糖酶活性的影響

圖4 結(jié)果顯示，在喂食BmNPV 后3 h，家蠶中腸海藻糖酶活性開始增加；在9 h 酶活性極顯著高于對照組（P＜0.01），為對照組的2.4倍；在12 h酶活性略低于對照組，但差異不顯著；在24 h 和48 h 海藻糖酶活性受到抑制，其酶活性大小分別降低至對照組的45.4%和13.5%，與對照組相比差異達到極顯著水平（P＜0.01）。

3 結(jié)論與討論

家蠶在遭受外源激素、殺蟲劑和病原微生物脅迫時，機體正常的生理活動發(fā)生紊亂，參與機體免疫防御反應(yīng)和物質(zhì)能量代謝的一系列相關(guān)酶的活性均會發(fā)生一定程度的變化。前人[20?21]研究發(fā)現(xiàn)，用蛻皮激素20E和保幼激素JH 處理家蠶，不僅能提高蠶體血淋巴酚氧化酶原（Prophenoloxidase，PPO）基因的表達，顯著增加酚氧化酶（Phenoloxidase，PO）活性，而且能激活中腸堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）的活性，增強其抗逆性。家蠶在遭受BmNPV 侵染時，機體的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和 過 氧 化 氫 酶（Catalase，CAT）活性及其基因表達量在感染中期顯著升高，表明SOD 和CAT 等抗氧化酶在家蠶的抗病毒過程中發(fā)揮一定的生物學(xué)功能[18]。

海藻糖酶作為昆蟲機體唯一能夠水解海藻糖的酶類，不僅參與調(diào)控機體的能量代謝過程，在對抗不良環(huán)境及應(yīng)對外源化合物和病原微生物脅迫時也發(fā)揮了一定的作用。家蠶海藻糖酶主要分布于血淋巴、腸液和脂肪體等組織，其在幼蟲每個齡期入眠時活性相對較高[22]。用致病性較高的球孢白僵菌感染家蠶幼蟲，蠶體海藻糖和糖原含量顯著降低，海藻糖酶活性受到抑制，其編碼基因顯著下調(diào)表達[23]。本研究結(jié)果顯示，在感染BmNPV 的前中期，家蠶血淋巴、脂肪體和中腸的海藻糖酶活性及BmTre基因的表達量均呈現(xiàn)增高的趨勢；而在感染BmNPV 后期，BmTrea基因的表達顯著抑制，編碼的海藻糖酶活性也開始急劇減弱。感染BmNPV 后，家蠶不同組織海藻糖酶活性及其基因的表達量整體呈現(xiàn)先逐漸升高后急劇減弱的變化趨勢。這與BmNPV 侵染蠶體的生理進程一致，在BmNPV 感染早期，病毒粒子雖然較少，但還是會對蠶體產(chǎn)生一定的攻擊，機體通過分泌或激活相關(guān)防御因子及各類水解酶和解毒酶，增強自身的防御能力。隨著BmNPV 感染時間的延長，病毒粒子大量增殖，蠶體各組織受損嚴(yán)重，正常生理代謝系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂，參與機體免疫防御反應(yīng)和物質(zhì)能量代謝的一系列酶的活性受到抑制。另外，家蠶不同組織的海藻糖酶對BmNPV 的響應(yīng)時間存在一定的差異。經(jīng)口喂食BmNPV，病毒最先接觸和攻擊腸道組織，破壞腸道的免疫防御系統(tǒng)和打破正常消化代謝體系的平衡，隨后進入血淋巴，最后侵染脂肪體。因此，中腸BmTre基因的表達量和海藻糖酶活性在喂食BmNPV 后3 h 就開始明顯增加，在9 h 達到最高值，隨后開始急劇降低。而血淋巴和脂肪體的BmTre基因分別在喂食BmNPV 后6 h 和9 h 才開始明顯上調(diào)表達，其海藻糖酶的活性也增強。

綜上，經(jīng)口喂食BmNPV，家蠶不同組織BmTre基因的表達量及海藻糖酶活性在感染前中期增加，感染后期急劇降低，這表明海藻糖酶不僅作為一類水解酶，通過水解機體的海藻糖為蠶體提供能量物質(zhì)，還可能作為一類免疫效應(yīng)因子參與了家蠶抵御病毒的侵染過程。