劉 玲，李春楠，蘭 夢(mèng)，吳孟雅，張 輝, ，邊學(xué)峰,

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117；2.吉林省東北亞生物科技有限公司，吉林長春 130117）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）以骨代謝紊亂、微結(jié)構(gòu)損壞為主要特征，并且由于骨量流失及強(qiáng)度降低，日后容易并發(fā)主要部位的脆性骨折[1]。OP的發(fā)病率隨著人口老齡化的加重而逐年上升。現(xiàn)已經(jīng)成為世界上第七大最常見的疾病[2]。研究顯示，中藥及其復(fù)方具有整體調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)激素水平，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)骨密度增加，改善和修復(fù)受損的小梁骨微結(jié)構(gòu)，治療OP患者的疾病[3?4]。中藥及其復(fù)方在預(yù)防和治療OP方面具有較高的安全性和獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，從靶向生物信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的角度進(jìn)行深入分析，對(duì)中醫(yī)藥防治OP具有重要意義。

人參為五加科植物（Panax ginsengC. A. Mey）。2020版藥典記載，其具有大補(bǔ)元?dú)猓瑥?qiáng)精補(bǔ)腎之功效。桑椹為?？浦参锷＃∕orus albaL.）的干燥果穗，2015版藥典記載歸心、肝、腎精，具有治療肝腎陰虛，關(guān)節(jié)不利之功效。腎虛是骨質(zhì)疏松癥的主要病因，而腎精的升降決定了骨的強(qiáng)弱，因此補(bǔ)腎中藥被廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的防治[5]。中醫(yī)認(rèn)為，腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨。從生理上講，腎臟儲(chǔ)蓄先天的精華，可以轉(zhuǎn)化為骨髓。骨髓儲(chǔ)存在骨頭里，骨髓充實(shí)則骨骼生長強(qiáng)硬；病理上，腎精虧虛，骨髓不足，骨質(zhì)流失，導(dǎo)致各種骨病。近年來，大量研究表明人參、桑椹都具有改善骨質(zhì)疏松的作用，但目前研究主要集中于單味藥的藥性，二者聯(lián)合用藥后改善骨質(zhì)疏松的研究未見報(bào)道，且人參、桑椹藥食同源，對(duì)于食品開發(fā)的研究具有廣闊前景，相比于西藥治療毒副作用小。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)自2008年發(fā)出以來[6]，其成為一門新興學(xué)科，在調(diào)控水平上揭示了中藥在人體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的作用。由于其整體性，系統(tǒng)性的研究方法以及藥物與中藥的多靶點(diǎn)，多病理特征共同作用的特點(diǎn)，已成為系統(tǒng)分析多靶點(diǎn)，多路徑機(jī)制的有效工具[7]。多項(xiàng)研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索中藥作用機(jī)制已經(jīng)取得成功[8?9]。

本實(shí)驗(yàn)主要通過人參水提液（GW）、桑椹水提液（MW）、人參醇提液（GC）、桑椹醇提液（MC）、人參和桑椹水提物配伍（GMW）、人參和桑椹醇提物配伍（GMC）六個(gè)試驗(yàn)組及以H2O2溶液組為睪丸間質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，地塞米松為成骨細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究人參、桑椹單味藥與藥對(duì)水提物及醇提物治療骨質(zhì)疏松作用的效果及其分子機(jī)制，為其后續(xù)開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3、小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；人參、桑椹 共二味藥材，吉林敖東世航藥業(yè)，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定，均為《中國藥典》2020年版收載品種；胎牛血清 美國Gibco公司；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT） 美國Amresco公司；MEM細(xì)胞培養(yǎng)液、雙抗（100 μg/mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素） 美國Hyclone公司；二甲基亞砜 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；小鼠睪酮（T）酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒 美國Rad公司；地塞米松索萊寶；BCA法蛋白定量試劑盒 中國碧云天；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒 中國南京建成。

BSA124S-CW電子天平 德國Sartorius；KS-5200DB型清洗器 昆山潔力美超聲儀器有限公司；Microfuge.22RCentrifuge型高速低溫離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；BIO Memory ?86 ℃超低溫冰箱 法國Froilabo公司；YZ-875超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠；多規(guī)格培養(yǎng)皿 美國Corning公司；HERAEUS HERA cell 150二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋公司；Milli-Q超純水儀 美國Bedford公司；Mode1680型酶標(biāo)儀 日本Takara公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 人參、桑椹單味藥及藥對(duì)1:1比例加入10倍量水，浸泡0.5 h，提取2次，每次提取1 h，合并2次濾液，得到人參水提液（GW）、桑椹水提液（MW）、人參和桑椹水提物配伍（GMW）藥液。再將人參、桑椹單味藥及藥對(duì)1:1比例加入8倍量乙醇，浸泡0.5 h，提取2次，每次提取2 h，合并2次濾液，得到人參醇提液（GC）、桑椹醇提液（MC）、人參和桑椹醇提物配伍（GMC）藥液。將六種樣品分別減壓濃縮再進(jìn)行烘干制成干膏，置4 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 凍存的MC3T3-E1細(xì)胞和TM3細(xì)胞復(fù)蘇后，在37 ℃恒溫條件下，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)含10%胎牛血清和MEM培養(yǎng)基的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞貼壁后，取出培養(yǎng)基，用PBS洗滌三次，直至無漂浮細(xì)胞。再次加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞被80%~90%覆蓋時(shí)，用0.25%胰蛋白酶傳代，每2~3 d傳代一次。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 單味藥及藥對(duì)不同組分對(duì)TM3細(xì)胞增殖率和睪酮分泌的影響 實(shí)驗(yàn)分為給藥組GW、MW、GC、MC、GMW、GMC，模型組（MS）和空白組（Control）。將給藥組成分溶于少量二甲基亞砜中，用培養(yǎng)基稀釋成12.5、25、50、100、200 μg/mL，對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基。將TM3細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液（4×103細(xì)胞/孔），每組5復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，分別加入12.5、25、50、100、200 μg/mL濃度樣品，對(duì)照組加入3.125 μmol/L的H2O2溶液。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞上清進(jìn)行睪酮檢測(cè)。每孔加入MTT（5 mg/mL），37 ℃暗孵4 h，于490 nm處檢測(cè)，根據(jù)吸光度計(jì)算各組細(xì)胞增殖率和睪酮分泌量。

1.2.4 MC3T3-E1細(xì)胞增殖試驗(yàn) MC3T3-E1細(xì)胞接種于96孔板中，24 h后加入不同濃度的樣品，使各組的終濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL。每組5個(gè)復(fù)孔。將其置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。24 h后，每孔加入MTT（5 mg/mL）試劑，37 ℃暗孵4 h。根據(jù)測(cè)定的吸光度，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。

1.2.5 MC3T3-E1細(xì)胞分化試驗(yàn) 用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞ALP活力。以加入地塞米松（100 μmol/L）作為模型組（MS），以12.5、25、50、100、200 μg/mL濃度的GMW和GMC作為給藥組，MC3T3-E1細(xì)胞為空白組。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到12孔板并培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的樣品，使各組的終濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL。24 h后，進(jìn)行檢測(cè)。具體方法按照BCA法蛋白定量試劑盒說明及ALP試劑盒說明操作進(jìn)行測(cè)定。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.3.1 人參-桑椹成分篩選、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在TCMSP[10]（http://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫以“人參”、“桑椹”、“RenShen”、“SangShen”為關(guān)鍵詞，收集人參-桑椹中化學(xué)成分，并以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）及類藥性（Drug-likeness，DL）的篩選條件（OB≥30%，DL≥0.18）[11]進(jìn)行篩選作為吸收、分布、代謝、排泄參數(shù)篩選出符合條件的化學(xué)成分作為活性成分并得到相關(guān)靶點(diǎn)，借助疾病靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫（Universal protein，UniProt）（https://www.uniprot.org/）查詢相關(guān)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名，并利用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行了分析，確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，分析人參-桑椹改善骨質(zhì)疏松癥的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.3.2 骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)收集 應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）輸入關(guān)鍵詞“Osteoporosis”收集骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)，并通過Uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為Uniprot Entry格式。應(yīng)用Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)（http://www.Venn.org/）將活性成分作用靶點(diǎn)與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到人參-桑椹藥對(duì)治療骨質(zhì)疏松癥關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.3.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入蛋白質(zhì)相互作用分析數(shù)據(jù)庫STRING（https://string-db.org/），選擇“Homo sapiens”，設(shè)定置信度≥0.400，分析關(guān)鍵靶點(diǎn)的相互作用，并將收集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.3.4 GO功能富集和KEGG通路富集 為探索關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物功能和作用通路，將關(guān)鍵靶點(diǎn)輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫[12]（https://david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行GO（Gene Ontology，基因本體）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書）分析，并以P<0.05為條件進(jìn)行篩選，選取基因數(shù)目排名前20的通路，利用imageGP（http://www.ehbio.com /ImageGP/）工具繪制氣泡圖。利用Cytoscape3.7.0軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得活性成分MOL2格式化學(xué)結(jié)構(gòu)，再利用 Pubchem數(shù)據(jù)庫（https://www.pubchem.org/）轉(zhuǎn)換為PDB格式。檢索RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）獲得蛋白晶體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Autodock[13]軟件進(jìn)行去水、加氫等操作后保存為PDB格式，應(yīng)用Pymol軟件對(duì)“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的度值大于平均值的化學(xué)成分和PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。使用GraphPad Prism 8.0繪制統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參、桑椹單味藥及藥對(duì)對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞的作用

2.1.1 單味藥及藥對(duì)對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3增殖率的影響 見表1，與空白組比較，模型組睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖率極顯著降低（P<0.01），表明小鼠腎衰模型建立成功。與模型組比較，當(dāng)濃度為100、200 μg/mL時(shí)GW、MW、GMW、GC、MC、GMC組增殖率顯著升高（P<0.01），并且呈濃度依賴性。GMW、GMC的增殖率明顯高于GW、MW、GC、MC的增殖率（P<0.05，P<0.01）。

表1 單味藥及藥對(duì)不同組分對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖作用（±s，n=3）Table 1 Proliferation effects of single drug and drug pair on mouse testicular TM3 cells (±s, n=3)

表1 單味藥及藥對(duì)不同組分對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖作用（±s，n=3）Table 1 Proliferation effects of single drug and drug pair on mouse testicular TM3 cells (±s, n=3)

注：與空白組比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比，*P<0.05，**P<0.01。

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2.1.2 GMW、GMC對(duì)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3睪酮分泌量的影響 通過TM3細(xì)胞增殖率的實(shí)驗(yàn)可知，藥對(duì)增值率大于單味藥增值率，所以對(duì)藥對(duì)睪酮分泌進(jìn)行分析。見圖1，與空白組比較，模型組睪酮分泌顯著降低（P<0.01），表明小鼠腎衰模型建立成功。與模型組比較，GMW、GMC組在25~200 μg/mL睪酮分泌顯著升高（P<0.01），并且呈濃度依賴性。

圖1 藥對(duì)水提GMW和藥對(duì)醇提GMC對(duì)TM3細(xì)胞睪酮分泌量的影響（±s，n=3）Fig.1 Effects of water extraction of GMW and alcohol extraction of GMC on testosterone secretion of TM3 cells

2.1.3 GMW、GMC對(duì)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖率的影響 見圖2，與空白組比較，GMW、GMC組的細(xì)胞增殖率顯著升高（P<0.05，P<0.01）。在GMW組中200 μg/mL濃度的細(xì)胞增殖率極顯著高于其他濃度組（P<0.01）。GMC組中100 μg/mL濃度的細(xì)胞，增殖率極顯著高于其他濃度組（P<0.01）。

圖2 藥對(duì)水提GMW和藥對(duì)醇提GMC對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖率的影響（±s，n=3）Fig.2 Effects of water extraction of GMW and alcohol extraction of GMC on proliferation rate of MC3T3-E1 cells

2.1.4 GMW、GMC 對(duì)小鼠成骨細(xì)胞 MC3T3-E1 ALP活力的影響 見圖3，與空白組比較，模型組ALP活力極顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，GMW中25 μg/mL濃度時(shí)ALP活力極顯著高于其他濃度的ALP活力（P<0.01）。GMC中200 μg/mL濃度時(shí)ALP活力極顯著高于其他濃度ALP活力（P<0.01）。

圖3 藥對(duì)水提GMW和藥對(duì)醇提GMC對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞 ALP 活力的影響（±s，n=3）Fig.3 Effects of water extraction of GMW and alcohol extraction of GMC on ALP activity of MC3T3-E1 cells

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.2.1 人參-桑椹活性成分篩選及“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到人參化學(xué)成分190種，桑椹中化學(xué)成分91種；通過設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18，人參中篩選出活性成分22種，桑椹中活性成分6種，其中兩者共有活性成分28種，見表2。并獲得活性成分相關(guān)作用靶點(diǎn)99個(gè)。將28種活性成分與2.2.2中所得到的交集69個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)通過Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖4。圖4中共有節(jié)點(diǎn)（Node）97個(gè)，邊（Edge）137條，綠色四邊形節(jié)點(diǎn)為人參-桑椹兩者共有成分，藍(lán)色三角形節(jié)點(diǎn)為靶標(biāo)蛋白。通過分析網(wǎng)絡(luò)性質(zhì)，活性成分M04、M14、M16、M27、M28的度值（Degree）高于平均值，M04、M14、M16是人參的活性成分，M27、M28是桑椹的活性成分，說明這些成分可能是人參-桑椹治療骨質(zhì)疏松癥關(guān)鍵成分。

圖4 人參-桑椹藥對(duì)活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Compound-target network of herbal pair ginseng and mulberry

表2 人參-桑椹中活性化合物的基本信息Table 2 Basic information of active compounds in ginseng-mulberry

2.2.2 藥物靶點(diǎn)基因篩選及關(guān)鍵基因獲取 通過檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫刪除重復(fù)項(xiàng)后得獲骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點(diǎn)4204個(gè)，與活性成分相關(guān)靶點(diǎn)取交集后共獲得69個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，見圖5。藍(lán)色圓形為活性成分靶點(diǎn)，紅色圓形為骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)，兩者交集為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖5 活性成分靶點(diǎn)和骨質(zhì)疏松癥靶點(diǎn)Venn圖Fig.5 Venn diagram of bioactive compound targets and Osteoporosis related targets

2.2.3 PPI網(wǎng)路構(gòu)建與分析 將69個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，基因類型改為“Homo sapiens”，并將置信度設(shè)置為medium confidence 0.400，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖TSV格式文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行可視化處理，其中有4個(gè)蛋白沒有互作關(guān)系，見圖6。圖6中共涉及65個(gè)節(jié)點(diǎn)（Node），638條邊（Edge）。PPI網(wǎng)路圖中，節(jié)點(diǎn)顏色從淡黃色漸變至深藍(lán)色表示Closeness Centrality從小到大變化。共有30個(gè)蛋白度值高于平均值（19.6），見表3，其中度值前五的蛋白為IL6、ALB、MAPK8、VEGFA、CASP3說明這5種蛋白在網(wǎng)絡(luò)中與其他蛋白相互作用較多，在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了重要作用。

表3 30個(gè)關(guān)鍵靶蛋白Table 3 30 key target proteins

圖6 65個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 PPI network of 65 key targets

2.2.4 GO功能富集和KEGG靶點(diǎn)通路富集分析經(jīng)過DAVID數(shù)據(jù)庫分析，以P<0.05為條件共收集到257個(gè)生物過程（biological process），34個(gè)分子功能（cell compound），62個(gè)細(xì)胞組分（molecular function）和109條KEGG通路，將GO功能富集排名前30的生物過程、分子功能、細(xì)胞組分及前20的KEGG通路繪圖從數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出。見圖7。所包含基因數(shù)最多的前20的通路詳細(xì)信息結(jié)果，見表4。將DAVID分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖8。圖8中藍(lán)色（左圖）菱形節(jié)點(diǎn)為兩者共有成分，綠色（中圖）四邊形節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白，紫色（右圖）長方形為通路。共有117個(gè)節(jié)點(diǎn)，406個(gè)邊，平均Degree值為6.719（該值是表示與該節(jié)點(diǎn)相連的邊的條數(shù)，節(jié)點(diǎn)度越高，其參與的生物過程越多），≥6.719的有44個(gè)，其介數(shù)（Betweenness Centrality）、接近中心性（Closeness Centrality）、平均最短路徑長度（Average Shortest Path Length）表明了其重要性，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，見表5。由此可知，相同成分可對(duì)應(yīng)一個(gè)或多個(gè)靶點(diǎn)，而不同成分又可作用于同一靶點(diǎn)，具有協(xié)同作用。

表5 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)（Degree≥6.719）Table 5 Network topology parameters (Degree≥6.719)

圖8 活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)路圖Fig.8 Active ingredient target pathway network diagram

表4 基因數(shù)目前20的KEGG通路基本信息Table 4 Basic information of the top 20 pathways with the most genes

圖7 GO功能富集和KEGG通路富集Fig.7 GO analysis and KEGG pathways

GO功能富集表明，人參-桑椹藥對(duì)可正調(diào)控RNA聚合II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄（positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、凋亡過程負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、腫瘤壞死因子細(xì)胞反應(yīng)（cellular response to tumor necrosis factor）、血管生成的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of angiogenesis）、神經(jīng)元凋亡過程（neuron apoptotic process）、上皮細(xì)胞增殖的陽性調(diào)節(jié)（positive regulation of epithelial cell proliferation）等生物過程。KEGG通路分析表明人參-桑椹藥對(duì)可能通過PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、乙型肝炎通路（Hepatitis B）、前列腺癌通路（Prostate cancer）、MAPK 信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路（AGERAGE signaling pathway）等信號(hào)通路發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松癥的作用?！俺煞?靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果顯示，槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、β-胡蘿卜素（beta-carotene）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）四種化合物在網(wǎng)絡(luò)圖中度值高于平均度值，提示這些化合物可能在人參-桑椹藥理作用的發(fā)揮中扮演重要角色。

2.2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 利用Autodock軟件，選取“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖中度值高于平均值的四個(gè)化合物（kaempferol、quercetin、beta-carotene、beta-sitosterol），與PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前四的靶點(diǎn)（CASP3、ALB、IL6、MAPK8）對(duì)接，除beta-carotene與靶點(diǎn)對(duì)接后binding energy大于0 kcal/mol外，其余結(jié)果均小于0 kcal/mol，說明活性成分和靶蛋白能形成較為穩(wěn)定的結(jié)合，見表6。利用Pymol軟件對(duì)活性化合物結(jié)果進(jìn)行可視化處理結(jié)果，見圖9。由圖可知，A、B、C分別為kaempferol、quercetin、betasitosterol與CASP3蛋白對(duì)接模式圖，D、E、F分別為kaempferol、quercetin、beta-sitosterol與ALB蛋白對(duì)接模式圖，G、H、I分別為kaempferol、quercetin、beta-sitosterol與IL6蛋白對(duì)接模式圖，J、K、L分別kaempferol、quercetin、beta-sitosterol與MAPK8蛋白對(duì)接模式圖。

圖9 活性成分與CASP3、ALB、IL6、MAPK8的分子對(duì)接模式Fig.9 Molecular docking pattern of bioactive compounds with CASP3、ALB、IL6、MAPK8 main protease

表6 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果（kcal/mol）Table 6 Docking results of active ingredients and key targets (kcal/mol)

3 討論

人參和桑椹為補(bǔ)氣補(bǔ)陰補(bǔ)肝腎的中藥。骨質(zhì)疏松癥現(xiàn)已在全球成為非常常見的疾病，并且對(duì)于抗骨質(zhì)疏松癥的藥物研發(fā)迫在眉睫。中醫(yī)理論中“腎主骨生髓”證實(shí)人參-桑椹有改善骨質(zhì)疏松的作用。然而其作用機(jī)制并不明確，同時(shí)缺乏分子水平實(shí)驗(yàn)研究。本研究以小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3為模型，考察了人參、桑椹單味藥和聯(lián)合藥對(duì)對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖及睪酮分泌的影響。結(jié)果顯示，聯(lián)合藥對(duì)對(duì)細(xì)胞增殖及睪酮分泌量具有顯著增加作用，說明藥對(duì)比單味藥具有明顯補(bǔ)腎的作用。以小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1為模型，考察不同組分藥對(duì)對(duì)細(xì)胞增殖及ALP活力的影響，結(jié)果顯示水提取的藥對(duì)組分具有明顯細(xì)胞增殖的作用，而醇提取的藥對(duì)則對(duì)ALP活力具有明顯增強(qiáng)的作用。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究了人參-桑椹改善骨質(zhì)疏松癥的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)和作用通路。發(fā)現(xiàn)人參-桑椹藥對(duì)可能通過 kaempferol、quercetin、beta-carotene、beta-sitosterol等 活性產(chǎn)物，作用于 IL6、ALB、MAPK8、VEGFA、CASP3、EGFR等靶點(diǎn)，正調(diào)控RNA聚合II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄、凋亡過程負(fù)調(diào)控、腫瘤壞死因子細(xì)胞反應(yīng)、血管生成的正向調(diào)節(jié)、神經(jīng)元凋亡過程、上皮細(xì)胞增殖的陽性調(diào)節(jié)等生物過程，通過PI3K-Akt信號(hào)通路、乙型肝炎通路、前列腺癌通路、MAPK信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等發(fā)揮多成分，多靶點(diǎn)、多通路治療骨質(zhì)疏松癥的藥理作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)圖參數(shù)顯示，人參桑椹治療骨質(zhì)疏松關(guān)鍵靶點(diǎn)主要有IL6、ALB、MAPK8、VEGFA、CASP3、EGFR等，30種蛋白度值高于平均值，這些結(jié)果表明，關(guān)鍵靶點(diǎn)與其它蛋白質(zhì)關(guān)系密切，在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有較強(qiáng)的相互作用。其中，白介素-6（IL-6）與OP密切相關(guān)，血清IL-6的升高是OP發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素[14]，IL-6能促進(jìn)成骨細(xì)胞釋放白介素-1（IL-1）、前列腺素E2（PGE2）等下游信號(hào)分子，降低OPG表達(dá)，升高RANKL表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，增強(qiáng)骨吸收[15]。目前認(rèn)為營養(yǎng)不良是OP發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素[16]，而血清白蛋白（ALB）是衡量機(jī)體營養(yǎng)狀況的重要指標(biāo)，臨床及實(shí)驗(yàn)研究顯示[17?18]，血清中ALB水平降低與骨密度下降呈明顯正相關(guān)，證實(shí)低水平ALB與OP的發(fā)病密切相關(guān)。徐會(huì)金[19]在體外培養(yǎng)人的巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MAPK可通過調(diào)控IRF-3來上調(diào)IFN-P基因的表達(dá)，從而起到抑制破骨分化，減弱骨吸收作用，對(duì)延緩骨質(zhì)疏松癥進(jìn)程起著重要作用。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）是血管內(nèi)皮生長因子家族中一種重要的細(xì)胞因子，可增加血管通透性，誘導(dǎo)血管生成。研究發(fā)現(xiàn)[20]，正常健康人群體內(nèi)VEGF表達(dá)較OP患病人群中高的多，證實(shí)其在維持骨代謝中起到重要的作用。其治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制可能是通過刺激血管內(nèi)皮，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性以此促進(jìn)成骨生成[21]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也已證實(shí)了[22]。將表達(dá)VEGF的腺病毒載體注射到新西蘭兔股骨遠(yuǎn)端，結(jié)果表明，表達(dá)VEGF的腺病毒載體能顯著增加兔股骨遠(yuǎn)端的骨量和成骨細(xì)胞數(shù)量。胱冬酶3（CASP3）是細(xì)胞線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白，正常情況下以非活化的形式存在，當(dāng)細(xì)胞凋亡程序啟動(dòng)時(shí)，CASP3被蛋白水解酶激活并與下游蛋白級(jí)聯(lián)以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]，因此調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞凋亡是許多中藥治療OP的重要作用機(jī)制[24]。EGFR是erbb家族四個(gè)成員之一的跨膜糖蛋白，構(gòu)成酪氨酸激酶受體。EGFR是一種重要的生長蛋白因子，能穩(wěn)定淺表軟骨細(xì)胞數(shù)量，增加邊界潤滑劑的分泌，潤滑軟骨表面，從而增強(qiáng)關(guān)節(jié)軟骨的力學(xué)強(qiáng)度[25]。研究[26]表明，EGFR的活化能高度刺激EGR-1、EGR-2和EGR-3的表達(dá)，通過促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞和原代顱骨細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡來維持其數(shù)量。

人參桑椹治療骨質(zhì)疏松癥的KEGG通路富集結(jié)果顯示，磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路作為細(xì)胞分化、增殖、遷移過程中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)者，在骨質(zhì)疏松病理過程中扮演著重要角色[27]。Adapala等[28]發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活性，將使破骨細(xì)胞骨吸收能力減弱，從而達(dá)到延緩骨質(zhì)疏松癥進(jìn)程的作用，其機(jī)制可能與激活下游的核因子κB受體活化因子（RANK）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體（c-Fms）信號(hào)相關(guān)。已有研究證明病毒性肝炎患者骨質(zhì)疏松癥發(fā)生率顯著增高，且與肝損害的程度呈正相關(guān)[29?30]。研究發(fā)現(xiàn)去勢(shì)治療前列腺癌能降低雄激素，同時(shí)經(jīng)雄激素芳香化而來的雌激素也減少，雌激素通過調(diào)節(jié)核因子κB體活化因子、核因子κB受體活化因子配體、骨質(zhì)疏松癥G通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)骨吸收，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[31?32]。目前對(duì)骨重塑機(jī)制的深入研究，慢性炎癥一定程度上參與了骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展，而這種慢性炎癥狀態(tài)及相關(guān)的氧化應(yīng)激可以通過激活晚期糖基化終末產(chǎn)物受體抑制WNT、ERK和PI3K信號(hào)抑制成骨細(xì)胞增殖[33?34]。研究表明，骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞具有更高的晚期糖基化終產(chǎn)物受體表達(dá)。晚期糖基化終產(chǎn)物激活受體可通過激活MAPK和核因子κB信號(hào)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分解代謝。由此可見，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路也有可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點(diǎn)。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選，發(fā)現(xiàn)kaempferol、quercetin、beta-carotene、beta-sitosterol化合物在“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中度值高于平均值。因此將這四種成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中度值前四的分子IL6、ALB、MAPK8、CASP3進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，除beta-carotene與靶點(diǎn)對(duì)接后binding energy大于0 kcal/mol外，其余binding energy結(jié)果均小于0 kcal/mol，說明人參-桑椹的活性化學(xué)成分可以和IL6、ALB、MAPK8、CASP3蛋白進(jìn)行較穩(wěn)定的結(jié)合。同時(shí)，已研究表明[35?38]，kaempferol、quercetin、beta-sitosterol均 表現(xiàn)出較好的抗癌、抗炎、抗氧化、抑制腫瘤及清除氧自由基的活性，表明這些成分在人參-桑椹藥對(duì)改善骨質(zhì)疏松癥作用中扮演了重要角色。