李詩(shī)穎,陳 琳,糜心怡,梁一凡,李 闖,鄭 義,2,
(1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,江蘇徐州 221018;2.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,江蘇徐州 221018)
銀杏(Ginkgo biloba)為銀杏科銀杏屬植物,是我國(guó)特有的中生代孑遺樹(shù)種。銀杏種仁(白果)為衛(wèi)計(jì)委認(rèn)定的藥食同源物質(zhì),具有益氣、潤(rùn)肺和定喘等功能。銀杏營(yíng)養(yǎng)成分豐富,干制品中蛋白含量13.2%,碳水化合物含量72.6%,粗脂肪含量1.3%,此外還含有豐富的維生素E及多種礦質(zhì)元素[1]。銀杏蛋白以清蛋白和球蛋白為主,氨基酸組成合理,必需氨基酸占比高,屬于優(yōu)質(zhì)植物蛋白[2]。鄧乾春等研究表明,銀杏白蛋白具有較好的清除超氧陰離子和拮抗DNA氧化損傷的活性[3],銀杏清蛋白可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)和抗氧化能力發(fā)揮對(duì)衰老小鼠、免疫抑制小鼠和S180腫瘤小鼠的保護(hù)作用[4?6]。
植物蛋白的提取有物理壓榨和溶劑浸提法等,其中溶劑浸提法是最常使用的方法。溶劑浸提法主要有水提酸沉法(water extraction and acid precipitation,WEAP)、堿提酸沉法(alkali extraction and acid precipitation, AEAP)和鹽提鹽析法,以及各種輔助提取技術(shù),如超聲輔助提取、微波輔助提取、酶輔助提取、反膠團(tuán)萃取和雙水相萃取等。目前已有數(shù)篇關(guān)于銀杏蛋白提取工藝的研究報(bào)道,李盼盼等優(yōu)化了銀杏蛋白超聲輔助提取的工藝參數(shù)[7],賈韶千等報(bào)道了銀杏蛋白堿法提取的最佳工藝[8],陳西娟考察了銀杏蛋白的鹽提鹽析法的工藝條件[9]。研究表明功能活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物活性會(huì)受到提取方法的影響[10?12]。彭倩等發(fā)現(xiàn)堿提酸沉法和鹽溶法提取的腰果蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性具有顯著性差異[13]。職士淇等研究表明超聲輔助堿提、鹽提和水提制備的青葉苧麻葉蛋白質(zhì)的功能特性各有優(yōu)劣[14]。有關(guān)提取方法對(duì)銀杏蛋白功能特性和抗氧化活性的研究未見(jiàn)報(bào)道。
本研究采用WEAP、AEAP和超聲輔助堿提酸沉法(ultrasound-assisted alkali extraction and acid precipitation, UA-AEAP)三種方法制備銀杏蛋白,考察提取方法對(duì)銀杏蛋白溶解度、起泡性、起泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性等功能特性的影響,同時(shí)考察提取方法對(duì)銀杏蛋白螯合亞鐵離子能力、清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基能力和清除羥基自由基能力的影響,旨在為銀杏蛋白資源的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
新鮮銀杏 2020年10月采自江蘇邳州;牛血清白蛋白、DPPH、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、菲啰嗪 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
FA2104N電子分析天平、723C可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;K9840自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司;LGJ-18A冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;SHZ-D(Ш)循環(huán)水式真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。
1.2.1 原料預(yù)處理 新鮮銀杏去外種皮、脫殼后,60 ℃下烘干至恒重,粉碎過(guò)60目,加入4倍體積石油醚,浸泡24 h脫脂,得到脫脂銀杏粉。
1.2.2 銀杏蛋白的制備 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了不同提取方法的工藝參數(shù)。WEAP提取條件:取50 g脫脂銀杏粉,按液料比20:1 mL/g分別加入去離子水,提取溫度60 ℃,提取時(shí)間2 h。AEAP提取條件:按液料比20:1 mL/g將脫脂銀杏粉與NaOH溶液混合,調(diào)pH10.0,提取溫度60 ℃,提取時(shí)間2 h。UA-AEAP工藝參數(shù):液料比20:1 mL/g,超聲功率200 W,超聲處理時(shí)間20 min,提取溫度60 ℃,提取時(shí)間40 min。提取后,3500 r/min離心20 min,收集上清液,調(diào)pH至銀杏蛋白的等電點(diǎn)4.4,4500 r/min離心20 min,所得沉淀透析(截留相對(duì)分子質(zhì)量3500 Da)72 h,濃縮,冷凍干燥,得銀杏蛋白。
1.2.3 銀杏蛋白得率及其化學(xué)成分的測(cè)定 蛋白含量的測(cè)定:GB 50095-2016凱氏定氮法;總糖含量的測(cè)定:苯酚硫酸法;粗脂肪含量的測(cè)定[15]:5009.6-2016索氏抽提法;灰分含量的測(cè)定:GB 5009.4-2016重量分析法。
銀杏蛋白得率計(jì)算公式如下:
1.2.4 銀杏蛋白溶解度的測(cè)定 將100 mg銀杏蛋白溶于20 mL去離子水中,調(diào)pH為2~12,室溫下攪拌30 min,4500 r/min離心20 min,收集上清液??捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中銀杏蛋白的含量。
1.2.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定 取500 mg銀杏蛋白分散于15 mL 0.01 mol·L?1磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中,記錄初始體積為V1(mL),10000 r/min均質(zhì)2 min,記錄泡沫體積為V2(mL),靜置30 min記錄體積記為V3(mL)。銀杏蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的計(jì)算公式如下:
1.2.6 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 取200 mg銀杏蛋白分散于20 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)中,室溫下攪拌30 min,加入5 mL大豆油,10000 r/min均質(zhì)2 min。吸取100 μL乳液,加入5 mL SDS,混勻,測(cè)定500 nm處的吸光度。銀杏蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的計(jì)算公式如下:
式中:N為稀釋倍數(shù);A1和A2分別為0和30 min時(shí)的吸光度;c為蛋白濃度,g/mL;θ為乳液中油相體積分?jǐn)?shù);Δt為兩次吸光度測(cè)定的間隔時(shí)間,min。
1.2.7 亞鐵離子螯合能力測(cè)定 采用Decker報(bào)道的方法[16],并稍加修改。將1 mL銀杏蛋白溶液(0.01~10 g/L)與3.7 mL 55%(v/v)乙醇、0.1 mL氯化亞鐵(2 mmol/L)和0.2 mL菲啰嗪(5 mmol/L)混勻,靜置20 min,測(cè)定562 nm處的吸光度。55%乙醇代替樣液作為空白對(duì)照。EDTA(0.01~10 g/L)作為陽(yáng)性對(duì)照。亞鐵離子螯合率計(jì)算公式如下:
式中:Ab和As分別為空白對(duì)照組和樣品組的吸光度。
1.2.8 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參考Wu等報(bào)道的方法[17]。取1.5 mL銀杏蛋白溶液(0.1~6 g/L),加入1.5 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L),混勻,室溫下置于暗處30 min,測(cè)定517 nm處的吸光度??箟难幔?.05~4 g/L)做陽(yáng)性對(duì)照。
式中:Ac為1.5 mL蒸餾水與1.5 mL DPPH混合液的吸光度;As為1.5 mL樣液與1.5 mL DPPH混合液的吸光度;Ab為1.5 mL樣液與1.5 mL 95%乙醇混合液的吸光度。
1.2.9 羥基自由基清除能力測(cè)定 采用鄰菲羅啉分光光度法[18]。銀杏蛋白質(zhì)量濃度為0.1~10 g/L,抗壞血酸(0.1~10 g/L)做陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)定536 nm處的吸光度。損傷組:取0.5 mL鄰菲羅啉(0.75 mmol/L),加入1 mL磷酸鹽緩沖液(0.15 mmol/L,pH7.4)和0.5 mL去離子水,混勻后加入0.5 mL 0.75 mmol/L FeSO4,0.5 mL 0.01% H2O2,37 ℃水浴60 min,測(cè)吸光度記為Ad。未損傷組:以0.5 mL去離子水代替0.01% H2O2,其他條件同損傷組,測(cè)吸光度記為Au。樣品組:以0.5 mL樣液代替0.5 mL去離子水,其他條件同損傷組,測(cè)吸光度記為As。樣品參比組:以0.5 mL去離子水代替0.5 mL鄰菲羅啉,其他條件同樣品組,測(cè)吸光度記為Ar??瞻讌⒈冉M:以0.5 mL去離子水代替0.5 mL樣液,其他條件同樣品參比組,測(cè)吸光度記為Ab。
式中:Ab、Ad、Ar、As和Au分別為空白對(duì)照組、損傷組、樣品參比、樣品組和未損傷組的吸光度。
每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行方差分析,組間多重比較采用Duncan法。
表1 為提取方法對(duì)銀杏蛋白得率和蛋白制品中化學(xué)成分的影響。由表1可知,不同提取方法制備的銀杏蛋白得率存在顯著性差異(P<0.05),其中UA-AEAP蛋白得率最高,達(dá)到了11.36%±0.10%。不同提取方法制備的銀杏蛋白產(chǎn)品中蛋白、總糖、粗脂肪和灰分含量均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。三種方法制備的銀杏蛋白純度均可以滿足功能特性分析的需要。UA-AEAP蛋白得率高,提取時(shí)間短,更加適用于銀杏蛋白的制備。
表1 提取方法對(duì)銀杏蛋白得率和蛋白產(chǎn)品中化學(xué)成分的影響Table 1 Effects of extraction methods on the yield of Ginkgo biloba proteins and the chemical components in the products
溶解度是蛋白質(zhì)的重要功能特性之一,乳化性、起泡性、起泡穩(wěn)定性等其他功能特性與溶解度密切相關(guān)[19]。圖1為不同提取方法對(duì)不同pH下銀杏蛋白溶解度的影響。由圖1可知,隨著pH的增大,三種提取方法制備的銀杏蛋白的溶解度均先降低后升高,溶解度在pH4.0左右都達(dá)到了最小值,這與李向陽(yáng)等[20]報(bào)道的銀杏蛋白在等電點(diǎn)處的溶解度最低相一致。在pH2~12的范圍內(nèi),UA-AEAP銀杏蛋白的溶解度最高,WEAP蛋白的溶解度略高于AEAP蛋白。結(jié)果提示,超聲處理可提高銀杏蛋白的溶解度,可能的原因是超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)可以降低蛋白質(zhì)顆粒聚集體的粒度。這與前人研究結(jié)果一致,超聲處理可顯著提高大豆親脂蛋白[21]、鷹嘴豆分離蛋白[22]和Oleosin蛋白[23]的溶解度。
圖1 提取方法對(duì)不同pH下銀杏蛋白溶解度的影響Fig.1 Effects of extraction methods on the solubility of Ginkgo biloba proteins at different pH
起泡性和泡沫穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)應(yīng)用于食品加工中最重要的功能特性之一,前者主要取決于蛋白質(zhì)溶液的溶解度、疏水基團(tuán)的數(shù)目和肽鏈的柔韌性等因素,而后者主要取決于蛋白質(zhì)溶液的流變學(xué)性質(zhì)[24]。圖2為不同提取方法對(duì)銀杏蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響。由圖2可知,UA-AEAP蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性顯著高于AEAP蛋白和WEAP蛋白(P<0.05),可能的原因是超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)降低了銀杏蛋白顆粒聚集體的粒度,同時(shí)降低水的界面張力,有利于蛋白分子的快速擴(kuò)散[25]。AEAP蛋白的起泡性顯著低于WEAP蛋白,但泡沫穩(wěn)定性顯著高于WEAP蛋白(P<0.05),可能的原因是水提法溶液的pH更接近蛋白的等電點(diǎn),被吸附到界面上的蛋白數(shù)量增加,從而提高了蛋白的起泡性[26]。
圖2 提取方法對(duì)銀杏蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of extraction methods on the foaming capacity and foam stability of Ginkgo biloba proteins
蛋白質(zhì)的乳化性能在食品加工中具有重要的意義,主要受到疏水基因的數(shù)目、界面張力等因素影響。圖3為提取方法對(duì)銀杏蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響。由圖3可知,UA-AEAP蛋白的乳化性顯著高于AEAP蛋白和WEAP蛋白(P<0.05),可能的原因是超聲處理增加了銀杏蛋白的溶解度,抑制蛋白聚集,提高乳液界面吸附蛋白能力[25]。WEAP蛋白的乳化性顯著高于AEAP蛋白(P<0.05),可能是因?yàn)閃EAP蛋白具有更高的溶解度。三種銀杏蛋白的乳化穩(wěn)定性無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
圖3 提取方法對(duì)銀杏蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of extraction methods on the emulsifying capacity and emulsion stability of Ginkgo biloba proteins
亞鐵離子等過(guò)渡態(tài)金屬離子可催化機(jī)體中的Fenton反應(yīng),引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化并產(chǎn)生羥基自由基,螯合亞鐵離子能力是評(píng)估受試物抗氧化活性的常用方法之一[27]。不同提取方法對(duì)銀杏蛋白螯合亞鐵離子能力的影響如圖4所示。三種銀杏蛋白均表現(xiàn)出較好的亞鐵離子螯合能力,且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí),WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對(duì)亞鐵離子的螯合率分別為21.78%±0.78%、12.92%±0.46%和18.78%±0.58%,而質(zhì)量濃度增加至8.0 g/L時(shí),螯合率分別提高到68.54%±3.01%、67.68%±3.21%和73.28%±3.45%。在低質(zhì)量濃度時(shí),三種銀杏蛋白對(duì)亞鐵離子螯合能力的順序?yàn)閃EAP>UA-AEAP>AEAP;而當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)3.0 g/L時(shí),UA-AEAP的螯合能力則高于WEAP和AEAP。銀杏蛋白對(duì)亞鐵離子的螯合能力可能是因?yàn)榘被釟埢械聂然然鶊F(tuán)與亞鐵離子發(fā)生了配位反應(yīng)。UA-AEAP蛋白具有更強(qiáng)的亞鐵離子螯合能力,可能是因?yàn)槌曁幚砟軌蚪档豌y杏蛋白聚集體的粒度,暴露出更多功能基團(tuán)[28]。許晶等研究表明,超聲預(yù)處理也可顯著提高大豆蛋白對(duì)亞鐵離子的螯合能力[29]。
圖4 提取方法對(duì)銀杏蛋白螯合鐵離子能力的影響Fig.4 Effects of extraction methods on the chelating ability against ferrous ions of Ginkgo biloba proteins
某種受試物的IC50低于10 g/L,則說(shuō)明該受試物具有一定的抗氧化能力[30]。利用Origin 2018對(duì)圖4數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性曲線擬合,得到WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對(duì)DPPH自由基清除能力的對(duì)數(shù)曲線方程分別為y=?31.56+43.32 ln(x+0.1.63),R2=0.9735,y=?57.88+53.008 ln(x+2.15),R2=0.9719和y=?16.92+41.33 ln(x+0.73),R2=0.9662。根據(jù)R2可知,擬合優(yōu)度較好,由上述方程計(jì)算得出WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對(duì)亞鐵離子螯合能力的IC50分別為4.94、5.48和4.32 g/L。由IC50可知,三種銀杏蛋白對(duì)亞鐵離子的螯合能力順序?yàn)閁AAEAP>WEAP>AEAP。陽(yáng)性對(duì)照的IC50為0.09 g/L,提示EDTA具有極強(qiáng)的螯合亞鐵離子的能力。
DPPH自由基清除能力是評(píng)估受試物抗氧化潛力的最常用方法之一,當(dāng)DPPH自由基被受試物清除時(shí),DPPH溶液的吸光度會(huì)降低,因此可用于評(píng)估受試物的清除自由基能力[31]。不同提取方法對(duì)銀杏蛋白清除DPPH自由基能力的影響如圖5所示。在0.05~6 g/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),三種銀杏蛋白的DPPH自由基清除率均與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。當(dāng)質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí),WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對(duì)DPPH自由基的清除率分別為42.61%±2.14%、41.63%±3.23%和50.47%±1.95%;當(dāng)質(zhì)量濃度升高至為5 g/L時(shí),清除率分別提高到70.45%±2.36%、68.78%±2.56%和74.92%±2.28%。與WEAP和AEAP蛋白相比,UA-AEAP蛋白具有更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力,可能的原因是超聲處理能降低銀杏蛋白的聚集度,暴露出更多的與自由基作用的基團(tuán)。Ma等研究表明,超聲處理可提高β-乳球蛋白對(duì)DPPH自由基的清除能力[32],這與本研究的結(jié)果相一致。
圖5 提取方法對(duì)銀杏蛋白清除DPPH自由基能力的影響Fig.5 Effects of extraction methods on the DPPH radical scavenging activity of Ginkgo biloba proteins
WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對(duì)DPPH自由基清除能力的對(duì)數(shù)曲線方程分別為y=37.69+19.31 ln(x+0.11),R2=0.9931,y=34.36+19.86 ln(x+0.15),R2=0.9911和y=45.54+17.79 ln(x+0.04),R2=0.9954。由上述方程計(jì)算得出WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對(duì)DPPH自由基能力的IC50分別為1.78、2.05和1.24 g/L,表明這三種銀杏蛋白均具有較高的清除DPPH自由基能力,清除能力順序?yàn)閁AAEAP>WEAP>AEAP??箟难岬腎C50為0.08 g/L,提示抗壞血酸具有極強(qiáng)的清除DPPH自由基能力。
羥基自由基被認(rèn)為是目前已知的氧化能力最強(qiáng)和危害性最大的活性氧之一,可通過(guò)電子轉(zhuǎn)移、加成和脫氫作用攻擊機(jī)體內(nèi)多種生物分子,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)的氧化損傷[33]。圖6為不同提取方法對(duì)銀杏蛋白清除羥基自由基能力的影響。由圖可知,WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對(duì)羥基自由基的清除活性與蛋白質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。在質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí),WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對(duì)羥基的清除率分別為25.5%±0.82%、22.56%±0.74%和28.62%±1.21%;當(dāng)質(zhì)量濃度增加至8.0 g/L時(shí),清除率分別為73.96%±2.73%、68.52%±2.64%和78.94%±2.95%。由此可知,UA-AEAP蛋白具有更強(qiáng)的羥基自由基清除能力,這與前人研究結(jié)果相一致,大豆球蛋白經(jīng)超聲預(yù)處理后對(duì)羥基自由基的清除能力顯著增強(qiáng)[29]。銀杏蛋白對(duì)羥基自由基的清除能力可能是因?yàn)榘被釟埢械聂然然鶊F(tuán)通過(guò)螯合亞鐵離子而阻斷Fenton反應(yīng),從而降低羥基自由基的產(chǎn)生。
圖6 提取方法對(duì)銀杏蛋白清除羥基自由基能力的影響Fig.6 Effects of extraction methods on thehydroxyl radical scavenging activity of Ginkgo biloba proteins
WEAP、AEAP和UA-AEAP蛋白對(duì)羥基自由基清除能力的對(duì)數(shù)曲線方程分別為y=10.25+28.13 ln(x+0.80),R2=0.9944,y=6.01+27.64 ln(x+0.79),R2=0.9946和y=17.76+27.40 ln(x+0.49),R2=0.9904,計(jì)算出IC50分別為3.31、4.12和2.76 g/L,由此可知,三種銀杏蛋白對(duì)羥基自由基清除能力的順序?yàn)閁A-AEAP>WEAP>AEAP??箟难岬腎C50為0.80 g/L,表明抗壞血酸具有極強(qiáng)的清除羥基自由基能力。
不同提取方法對(duì)銀杏蛋白得率的影響較大,其中UA-AEAP蛋白得率最高,達(dá)11.36%±0.10%,顯著高于WEAP和AEAP。三種提取方法制備的銀杏蛋白純度均較高,可以滿足功能特性分析的需要。銀杏蛋白溶解度受到提取方法的影響,UA-AEAP蛋白的溶解度最高,WEAP蛋白的溶解度略高于AEAP蛋白。提取方法顯著影響了銀杏蛋白的起泡性、泡沫穩(wěn)定性和乳化性等功能特性,而對(duì)乳化穩(wěn)定性無(wú)顯著性影響;UA-AEAP蛋白的起泡性、泡沫穩(wěn)定性和乳化性均優(yōu)于AEAP和WEAP蛋白。提取方法影響了銀杏蛋白的抗氧化活性,銀杏蛋白的螯合亞鐵離子能力、清除DPPH自由基能力和清除羥基自由基能力的順序均為:UA-AEAP>WEAP>AEAP。綜上所述,UA-AEAP蛋白得率高、抗氧化能力和功能特性優(yōu)于另外兩種方法,更適于銀杏蛋白的制備。本研究考察了提取方法對(duì)銀杏蛋白功能特性及抗氧化活性的影響,為銀杏蛋白在食品體系中的應(yīng)用及功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ),后續(xù)將進(jìn)一步研究不同提取方法對(duì)銀杏蛋白氨基酸組成、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞基組成、分子構(gòu)象等結(jié)構(gòu)的影響。