矯麗曼

(遼寧省楊樹(shù)研究所,遼寧 蓋州 115213)

楊樹(shù)具有生長(zhǎng)快、抗逆性強(qiáng)、輪伐期短、產(chǎn)量高、易于更新等特點(diǎn)，作為主要造林樹(shù)種在遼寧省內(nèi)廣泛栽培[1]。但一些地區(qū)不能做到合理造林、生態(tài)功能減退、病蟲(chóng)害防治技術(shù)缺乏等原因致使楊樹(shù)病蟲(chóng)害發(fā)生嚴(yán)重，給林業(yè)生產(chǎn)造成巨大損傷，威脅著楊樹(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。

楊樹(shù)爛皮病又稱腐爛病，病原有性階段為污黑腐皮殼(ValsasordidaNit.)，無(wú)性階段為金黃殼囊孢菌(Cytosporachrysosperma(Pers.) Fr.)[3]。通常分為枝枯型和干腐型。枝枯型主要發(fā)生在苗木、幼樹(shù)及大樹(shù)的枝條，發(fā)病初期病斑呈暗灰色，后期散生許多黑色小點(diǎn)，分生孢子器[4-5]；干腐型主要發(fā)生于主干、大枝和分杈處，發(fā)病初期病斑呈暗褐色、水漬狀，后期在病斑上長(zhǎng)出許多針狀黑色小突起，即分生孢子器。爛皮病是楊樹(shù)重要的枝干病害之一[6]，如發(fā)生日灼、凍害、干旱等不利于楊樹(shù)生長(zhǎng)環(huán)境條件，就會(huì)引起楊樹(shù)干部創(chuàng)傷、樹(shù)勢(shì)衰弱、爛皮病大面積發(fā)生，導(dǎo)致被害樹(shù)木樹(shù)勢(shì)衰弱，甚至枯死，嚴(yán)重時(shí)造成楊樹(shù)大片死亡[7-8]。

楊樹(shù)爛皮病常采用化學(xué)農(nóng)藥防治，但化學(xué)農(nóng)藥的過(guò)度使用造成了很多負(fù)面影響，如破壞生態(tài)平衡、產(chǎn)生抗藥性等。如何安全有效地使用生物農(nóng)藥，一直是林業(yè)工作者研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。研究選用了一種新型生物發(fā)酵殺菌劑中生菌素，初探其對(duì)楊樹(shù)爛皮病病原菌的抑菌機(jī)制，為楊樹(shù)爛皮病病害科學(xué)防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌株

楊樹(shù)爛皮病(88513)，購(gòu)自中國(guó)林業(yè)科學(xué)院林業(yè)菌種保存中心。

1.2 藥劑

有效成分含量3%中生菌素(江西正邦作物保護(hù)有限公司)，考馬斯亮藍(lán)G-250(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，牛血清白蛋白(BioFroxx)，丙二醛試劑盒(南京建成A003-2)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 中生菌素對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌絲生長(zhǎng)及生物量的影響

根據(jù)藥劑使用說(shuō)明書(shū)用量配成多個(gè)梯度濃度的溶液，在無(wú)菌條件下，加入到未凝固的PDA固體培養(yǎng)基中，使藥劑在培養(yǎng)基中的最終稀釋400、600、800、1000倍液，倒入無(wú)菌平皿中。用直徑5 mm無(wú)菌打孔器在預(yù)先培養(yǎng)好的楊樹(shù)爛皮病病原菌菌絲平面上打孔，待培養(yǎng)基冷卻后用無(wú)菌鑷子夾取一片圓形菌絲片接種于培養(yǎng)基中央，用封口膜封好，放置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中，倒立暗培養(yǎng)，同時(shí)以加無(wú)菌水的培養(yǎng)基作對(duì)照，每處理5次重復(fù)。采用十字交叉法每隔12 h觀察并測(cè)定菌絲生長(zhǎng)的直徑，取各處理的平均值[9-10]。

將PDA液體培養(yǎng)基等量分裝于大三角瓶中，滅菌待冷卻后在無(wú)菌條件下加入不同質(zhì)量的中生菌素藥劑，使藥劑在液體培養(yǎng)基中最終稀釋400、600、800、1000倍液，再接入直徑5 mm的菌絲片，放置于25 ℃搖床中培養(yǎng)。以不加藥劑為對(duì)照組，當(dāng)對(duì)照組長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基時(shí)，終止培養(yǎng)，取出菌絲用無(wú)菌蒸餾水沖洗干凈，用8層紗布過(guò)濾擰干，冷凍干燥后稱量干重[11-12]。

2.2 中生菌素對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌絲內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

以牛血清白蛋白為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定菌絲內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量[13]。取各處理干菌絲100 mg放于無(wú)菌研缽中，迅速加液氮研磨成粉末，然后用預(yù)冷生理鹽水稀釋至10 mL，取樣品液0.1 mL，加入去離子水0.9 mL，再加入考馬斯亮藍(lán)溶液5mL，混勻后放置2 min，以加等量無(wú)菌去離子水為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。以對(duì)照管調(diào)零，測(cè)量各樣品OD595nm,并通過(guò)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白含量[14-15]。

2.3 中生菌素對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌菌絲體內(nèi)丙二醛(MDA)含量的影響

MDA含量測(cè)定采用TBA法。取各處理干菌絲100 mg，放于冷凍研缽中加液氮低溫研磨成粉末，用預(yù)冷生理鹽水溶液稀釋至10 mL,2500 r/min 4 ℃超低溫離心5 min，取上清液按照南京建成A003-1試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行菌絲體內(nèi)丙二醛含量的測(cè)定[16-17]。

3 結(jié)果與分析

3.1 中生菌素對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌菌絲生長(zhǎng)及生物量的影響

楊樹(shù)爛皮病病原菌生長(zhǎng)緩慢。當(dāng)培養(yǎng)10 d時(shí)，對(duì)照菌絲已延伸至平皿邊緣，且菌絲為白色，未產(chǎn)生孢子；而在含中生菌素各培養(yǎng)基中菌絲向外延伸很小，且菌絲均為白色。各處理菌絲生長(zhǎng)抑制率見(jiàn)表1。當(dāng)中生菌素稀釋倍數(shù)小于800倍液時(shí)，抑菌率大于85%，且各處理菌絲生長(zhǎng)直徑在P<0.05水平上存在顯著性差異，抑菌率也存在顯著性差異。可見(jiàn)隨著中生菌素藥劑稀釋倍數(shù)的減小，抑制率逐漸增大。

楊樹(shù)爛皮病菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d時(shí)，對(duì)照組菌絲已長(zhǎng)滿整個(gè)液體發(fā)酵培養(yǎng)基。結(jié)果如表1，對(duì)照組100 mL發(fā)酵液中菌絲干重為(74.78±1.24) mg，而處理組菌絲干重明顯低于對(duì)照組，800倍稀釋液處理組100 mL發(fā)酵液的菌絲干重為(7.99±0.98) mg，而400倍稀釋液的為(2.97±0.49) mg。可見(jiàn)不同稀釋倍數(shù)中生菌素對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌絲生長(zhǎng)及生物量都有影響，能顯著抑制菌絲的生長(zhǎng)。

表1 中生菌素對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌菌絲生長(zhǎng)及生物量的抑制作用

3.2 中生菌素對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1，蛋白質(zhì)含量(Y)與吸光值(x)的回歸方程為：Y=0.0066x +0.0123，相關(guān)系數(shù)R2=0.9989。根據(jù)試驗(yàn)測(cè)得的各處理吸光值(OD595)計(jì)算出相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量。如圖2，培養(yǎng)10 d后，對(duì)照菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量為(6.48±1.05) μg/mL，處理組的可溶性蛋白質(zhì)含量明顯低于對(duì)照組，800倍稀釋液的處理組菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量為(0.81±0.16) μg/mL，并隨著稀釋倍數(shù)減小菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量也隨之減少。可見(jiàn)中生菌素能明顯抑制楊樹(shù)爛皮病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)含量降低。

圖1 蛋白T質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

各柱形圖上的小寫(xiě)字母表示差異顯著性水平(P<0.05)

3.3 中生菌素對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌絲體內(nèi)丙二醛(MDA)含量的影響

結(jié)果如圖3，當(dāng)培養(yǎng)10 d后，對(duì)照組菌絲體內(nèi)丙二醛含量為(1.18±0.18) mmol/g，800倍稀釋液的處理組菌絲體內(nèi)丙二醛含量為(2.03±0.23) mmol/g，而400倍稀釋液的處理組菌絲體內(nèi)丙二醛含量為(2.67±0.30) mmol/g，并在P<0.05水平上存在顯著性差異?？梢?jiàn)中生菌素藥劑處理組菌絲體內(nèi)丙二醛的含量明顯高于對(duì)照組，表明菌絲細(xì)胞在受到藥劑脅迫時(shí)，細(xì)胞膜受到破壞，膜脂化加劇，產(chǎn)生大量的MDA。

各柱形圖上的小寫(xiě)字母表示差異顯著性水平(P<0.05)

4 結(jié)論與討論

初步報(bào)道了中生菌素對(duì)楊樹(shù)爛皮病的抑菌機(jī)制，主要從對(duì)菌絲生長(zhǎng)和生物量的影響及對(duì)菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)和丙二醛含量四個(gè)方面進(jìn)行了研究。初步確定中生菌素對(duì)楊樹(shù)爛皮病菌絲生長(zhǎng)及生物量有明顯的抑制作用；能顯著抑制楊樹(shù)爛皮病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)含量降低；并對(duì)菌絲細(xì)胞有很大破壞作用，細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度增大，細(xì)胞受損嚴(yán)重，導(dǎo)致丙二醛含量增大。

中生菌素是一種新型農(nóng)用抗生素、較廣的保護(hù)型殺菌劑。本文僅從幾個(gè)方面進(jìn)行了抑菌機(jī)制研究，在今后試驗(yàn)中，還應(yīng)該從抑制菌絲體內(nèi)各種合成和代謝酶活性等方面進(jìn)行更深層次的研究，較詳細(xì)分析中生菌素的抑菌機(jī)理。通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)中生菌素對(duì)楊樹(shù)爛皮病有較好的抑制效果，可以應(yīng)用于林業(yè)真菌性病害的防治，為林業(yè)病害科學(xué)防治提供一定的理論依據(jù)。