李淑楨，王 琦，李沁園，申繼強，李長興，吳佩鋒，張立雪，代冬芳*

1.青海大學醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究中心，青海 西寧 810006

2.西北民族大學 醫(yī)學部，甘肅 蘭州 730000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是女性進入圍絕經(jīng)期后常見癥狀之一。隨著人口老齡化加劇，女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者人數(shù)已高達2億[1]。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素減少是PMOP發(fā)生的主要原因，對因治療是臨床主要手段，但長期內(nèi)源性雌激素治療具有一定風險性，患者可能會并發(fā)乳腺癌、靜脈血管栓塞、心血管疾病、子宮內(nèi)膜癌等嚴重疾病[2]。為減少并發(fā)癥，研究人員提出使用植物雌激素治療方法。目前已有大量臨床研究證實，植物雌激素具有防治PMOP的作用[3-5]。

藏藥二十五味鬼臼丸作為青藏地區(qū)特色性藥物，是當?shù)赜糜谥委熍試^經(jīng)期綜合征的首選藥物之一，其主要組成為鬼臼，鬼臼中的木脂素屬于植物雌激素[6]。已有臨床試驗證明，該藥能夠改善圍絕經(jīng)期女性出現(xiàn)的諸多癥狀[7-8]。然而二十五味鬼臼丸臨床療效機制的研究仍停留在臨床經(jīng)驗的積累上，對其實驗藥效學和作用機制研究的報道極少，這遠不能滿足現(xiàn)代臨床和市場的需要，因此，本實驗通過建立PMOP動物模型觀察二十五味鬼臼丸在下丘腦-垂體-卵巢軸（hypothalamus-pituitary-ovary axis，HPOA）上對PMOP的影響，為臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雌性未孕SD大鼠40只，4月齡，體質(zhì)量（220±20）g，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心所提供，動物許可證號：SCXK（陜）2018-001。飼養(yǎng)環(huán)境室溫（22±1）℃，自由攝食、飲水，12 h晝夜自然規(guī)律。實驗過程遵循青海大學醫(yī)學院實驗動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定（批準文號QHDX2021000541）。

1.2 藥物與試劑

戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國藥準字J20171038，批號547A）；藏藥二十五味鬼臼丸（青海省藏醫(yī)院，國藥準字Z20140539，規(guī)格0.35 g×49丸/瓶，批號626189）；TRIzol Reagent（美國Ambion公司，批號229001）；PCR引物由日本TaKaRa公司合成；RNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號AT311）；熒光定量PCR試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號AQ141）；EDTA脫鈣液（北京索萊寶科技有限公司，批號E1171）；HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號G1120）；大鼠血清雌二醇、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone，GnRH）ELISA試劑盒（江蘇酶標生物科技有限公司，批號分別為MB-2116A、MB-6623A、MB-2107A、MB-2062A）。大鼠ERα和ERβ多克隆抗體、β-actin（英國Abcam公司，批號ab3575、ab3576、ab8227）；DAPI染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C1006）；Cy3標記羊抗兔IgG（北京博奧森生物工程有限公司，批號A0516）。

1.3 主要儀器

Centrifuge 5418R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Nanodrop 2000（美國Thermo公司）；Light Cycler96實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；HistoCore Pearl全封閉組織脫水機（德國Leica公司）；HistoCoreArcdia石蠟包埋機（德國Leica公司）；SkyScan 1176小動物Micro-CT掃描儀（德國Bruker公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

適應性喂養(yǎng)1周后，將40只SD未孕雌性大鼠中隨機分為假手術(shù)組、模型組、雌二醇組、二十五味鬼臼丸組。除假手術(shù)組僅摘除卵巢旁同等大小的脂肪組織，其余3組建立PMOP動物模型。術(shù)前禁食12 h不禁水，將大鼠固定在手術(shù)臺后，每只大鼠ip 10%水合氯醛（3 mL/kg），深度麻醉后備皮，碘伏消毒，沿腹直肌中線做腹正中切口2～3 cm，暴露腹腔后將腹內(nèi)容物推向一側(cè)可見呈V字型的子宮，沿子宮角向上可見桑葚狀卵巢。除假手術(shù)組外，其他各組大鼠均摘取雙側(cè)卵巢，建立PMOP動物模型。術(shù)后im青霉素（20萬U/只）連續(xù)3 d預防感染。術(shù)后3 d對各組大鼠逐只進行陰道涂片，1次/d，連續(xù)5 d，若動物不出現(xiàn)動情期反應則表示造模成功。手術(shù)1周后開始ig給藥處理，按照臨床等效劑量計算，雌二醇組大鼠用藥劑量為0.1 mg/kg，二十五味鬼臼丸組大鼠用藥量為441 mg/kg，其余2組ig等體積蒸餾水，每日給藥，持續(xù)12周。

2.2 標本制備

最后1次給藥后，禁食12 h，大鼠深度麻醉，腹主動脈取血，分離出雙側(cè)股骨，冰上操作，剔除周圍附著的肌肉和韌帶等軟組織后，用生理鹽水反復沖洗，將左側(cè)股骨置于凍存管中-80 ℃保存?zhèn)溆?，右?cè)股骨置于4%多聚甲醛固定備用；大鼠斷頭處死后，冰上摘取下丘腦和垂體，生理鹽水反復沖洗后，分別置于凍存管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 ELISA檢測各組大鼠血清性激素水平變化

EDTA抗凝管腹主動脈取血后，上下顛倒混勻，靜置20 min左右，4 ℃，3000 r/min，離心20 min后收集上清液，按試劑盒要求檢測雌二醇、LH、FSH、GnRH水平。

2.4 RT-PCR檢測下丘腦、垂體和股骨的雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）、ERβ mRNA表達

各組分別取100 mg下丘腦、垂體和左側(cè)股骨遠端，加入Trizol提取組織總RNA，按試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量。每組設(shè)3個平行復孔，以β-actin為內(nèi)參基因，記錄各組Ct值。運用2-ΔΔCt相對定量法計算各組目的基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物長度Table 1 Primer sequences and amplification products length

2.5 免疫熒光雙標檢測下丘腦、垂體和股骨ERα及ERβ蛋白表達

將大鼠下丘腦、垂體、右側(cè)股骨脫水包埋后，切成5 μm厚度的切片后，依次進行烤片、脫蠟、水化、抗原修復、封閉、一抗孵育（1∶200）、標記、染色、脫水、透明等步驟，封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，圖像用Image J 6.0軟件分析，測定平均熒光強度。

2.6 HE染色觀察股骨形態(tài)變化

右側(cè)股骨遠端置于4%多聚甲醛固定48 h后，PBS緩沖液沖洗3次，20 min/次，放入EDTA脫鈣液中，置于37 ℃恒溫箱中脫鈣4周，直至大頭針能刺穿股骨后停止脫鈣。隨后進行脫水、透明、包埋、切片等步驟，按HE染色步驟染色后，顯微鏡下觀察骨形態(tài)變化。

2.7 Micro-CT檢測股骨微結(jié)構(gòu)變化

應用Micro-CT CT50成像系統(tǒng)（Micro-CT CT50，Sanco Medical）評價大鼠右側(cè)股骨遠端的微觀結(jié)構(gòu)，分辨率為18 μm，并采用系統(tǒng)分析軟件選定目的區(qū)域骨組織分析骨體積（bone volume，BV）、相對骨體積 [BV/組織體積（tissue volume，TV）]、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁分離度（trabecular separation/spacing，Tb.Sp），所有標本的分析范圍保持一致。

2.8 統(tǒng)計學分析

研究數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，采用SPSS 19.0軟件進行分析，組間比較進行單因素方差齊性分析，若方差齊，組間比較采用LSDt檢驗；若方差不齊，組間比較采用Dunnett’st檢驗，P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清性激素水平的變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清雌二醇水平顯著下降（P＜0.01），LH、FSH、GnRH水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，雌二醇組大鼠血清雌二醇水平顯著升高（P＜0.01），LH、FSH、GnRH水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，二十五味鬼臼丸組大鼠血清雌二醇水平變化無統(tǒng)計學意義，但LH、FSH、GnRH水平顯著下降（P＜0.05、0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清性激素水平的變化 ( ±s , n=9)Table 2 Changes of serum sex hormone levels in rats of each group ( ±s , n=9)

表2 各組大鼠血清性激素水平的變化 ( ±s , n=9)Table 2 Changes of serum sex hormone levels in rats of each group ( ±s , n=9)

與假手術(shù)組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同**P ＜ 0.01 vs Sham group; #P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group, same as below

組別 雌二醇/(pmol·L-1) LH/(mIU·mL-1) FSH/(IU·L-1) GnRH/(mIU·mL-1)假手術(shù) 71.59±1.66 10.72±0.36 10.79±0.40 75.60±4.15模型 59.31±0.68** 13.42±0.44** 14.10±0.17** 90.05±1.55**雌二醇 67.73±0.62## 11.32±0.22## 11.86±0.15## 81.85±1.08##二十五味鬼臼丸 60.67±0.48 11.78±0.26## 12.52±0.24## 85.05±1.78#

3.2 各組大鼠下丘腦、垂體和股骨ERα、ERβ mRNA水平變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠下丘腦ERα、ERβmRNA顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，雌二醇組和二十五味鬼臼丸組下丘腦ERαmRNA表達水平明顯升高（P＜0.01），但ERβmRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 各組大鼠下丘腦ERα、ERβ mRNA水平的變化(±s , n=9)Fig.1 Changes of ERα and ERβ mRNA levels in hypothalamus of rats in each group (±s , n=9)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠垂體ERα、ERβmRNA表達水平顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，雌二醇組和二十五味鬼臼丸組垂體ERαmRNA表達水平明顯升高（P＜0.01）；雌二醇組垂體ERβmRNA表達水平明顯升高（P＜0.01），二十五味鬼臼丸組垂體ERβmRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠垂體ERα、ERβ mRNA水平的變化(±s , n=9)Fig.2 Changes of ERα and ERβ mRNA levels in pituitary of rats in each group (±s , n=9)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨ERα、ERβmRNA表達水平顯著下降（P＜0.01）。與模型組比較，雌二醇組股骨ERα、ERβmRNA表達水平明顯升高（P＜0.01），二十五味鬼臼丸組股骨ERβmRNA表達水平明顯升高（P＜0.01），但ERαmRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)果見圖3。

圖3 各組大鼠股骨ERα、ERβ mRNA水平的變化(±s , n=9)Fig.3 Changes of ERα and ERβ mRNA levels in femur of rats in each group (±s , n=9)

3.3 各組大鼠下丘腦、垂體和股骨ERα、ERβ蛋白水平變化

下丘腦免疫熒光染色顯示（圖4），ERα蛋白表達陽性為紅色，ERβ蛋白表達陽性為綠色。免疫熒光結(jié)果（圖5）顯示，與假手術(shù)組比較，模型組ERα、ERβ蛋白平均熒光強度顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，雌二醇組和二十五味鬼臼丸組ERα蛋白平均熒光強度顯著增強（P＜0.01），而ERβ蛋白平均熒光強度差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 下丘腦ERα、ERβ熒光染色 (×100)Fig.4 Fluorescence staining of ERα and ERβ inpituitary in hypothalamus (× 100)

圖5 下丘腦ERα、ERβ蛋白半定量分析結(jié)果 (±s , n=9)Fig.5 Results of semi-quantitative analysis of ERα and ERβ proteins in hypothalamus (±s , n=9)

垂體免疫熒光染色顯示（圖6），ERα蛋白表達陽性為紅色，ERβ蛋白表達陽性為綠色。免疫熒光結(jié)果（圖7）顯示，與假手術(shù)組比較，模型組ERα、ERβ蛋白平均熒光強度顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，雌二醇組ERα、ERβ蛋白平均熒光強度顯著增強（P＜0.01）；二十五味鬼臼丸組ERα蛋白平均熒光強度顯著增強（P＜0.01），ERβ蛋白平均熒光強度差異無統(tǒng)計學意義。

圖6 垂體ERα、ERβ熒光染色 (×100)Fig.6 Fluorescence staining of ERα and ERβ in pituitary (× 100)

圖7 垂體ERα、ERβ蛋白半定量分析結(jié)果 (±s , n=9)Fig.7 Results of semi-quantitative analysis of ERα and ERβ proteins in pituitary (±s , n=9)

股骨免疫熒光染色顯示（圖8），ERα蛋白表達陽性為紅色，ERβ蛋白表達陽性為綠色。免疫熒光結(jié)果（圖9）顯示，與假手術(shù)組比較，模型組ERα、ERβ蛋白平均熒光強度顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，雌二醇組ERα、ERβ蛋白平均熒光強度顯著增強（P＜0.01）；二十五味鬼臼丸組ERβ平均熒光強度顯著增強（P＜0.01），ERα蛋白平均熒光強度差異無統(tǒng)計學意義。

圖8 股骨ERα、ERβ熒光染色 (×50)Fig.8 Fluorescence staining of ERα and ERβ in femur (× 50)

圖9 股骨ERα、ERβ蛋白半定量分析結(jié)果 (±s , n=9)Fig.9 Results of semi-quantitative analysis of ERα and ERβ proteins in femur ( ±s , n=9)

3.4 股骨形態(tài)變化

假手術(shù)組骨小梁排列有序，結(jié)構(gòu)致密完整；模型組大鼠骨小梁稀疏，排列紊亂甚至中斷，腔隙變大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)損壞；與模型組比較，雌二醇組骨小梁明顯增多，排列尚規(guī)則，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)明顯修復；二十五味鬼臼丸組骨小梁明顯增多，但排列仍有中斷，可見腔隙間仍有少量脂肪細胞填充。見圖10。

圖10 各組大鼠股骨形態(tài)變化 (HE，×400)Fig.10 Morphological changes of femur in each group (HE, × 400)

3.5 各組大鼠股骨Micro-CT掃描及微結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化

與假手術(shù)比較，模型組大鼠BV、BV/TV、Tb.N顯著下降（P＜0.01），Tb.Sp顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，雌二醇組和二十五味鬼臼丸組BV、BV/TV、Tb.N顯著升高（P＜0.01），Tb.Sp顯著下降（P＜0.01）。見圖11和表3。

表3 各組大鼠股骨計量學結(jié)果 (±s , n=9)Table 3 Femur histometric results in rats of each group (±s , n=9)

表3 各組大鼠股骨計量學結(jié)果 (±s , n=9)Table 3 Femur histometric results in rats of each group (±s , n=9)

組別 BV/mm3 (BV/TV)/% Tb.N/(μm-1) Tb.Sp/μm假手術(shù) 3.52±0.23 63.56±3.02 0.004 5±0.000 2 107.15±14.54模型 0.60±0.26** 11.34±3.03** 0.001 1±0.000 5** 412.20±72.08**雌二醇 2.73±0.29## 50.41±7.18## 0.004 2±0.000 1## 135.19±23.56##二十五味鬼臼丸 1.58±0.26## 31.44±5.18## 0.003 2±0.000 4## 214.97±23.02##

圖11 各組大鼠股骨遠端Micro-CT掃描結(jié)果Fig.11 Micro-CT scan results of rat distal femurs in each group

4 討論

HPOA作為經(jīng)典調(diào)節(jié)軸，是調(diào)節(jié)女性體內(nèi)性激素水平穩(wěn)定的主要神經(jīng)內(nèi)分泌軸。在女性進入圍絕經(jīng)期之前，HPOA軸能夠維持激素水平穩(wěn)定，而女性進入圍絕經(jīng)期之后，由于卵巢功能衰退，體內(nèi)雌激素水平顯著下降，HPOA軸已不能發(fā)揮其正常功能，導致下丘腦、垂體釋放大量GnRH、LH、FSH。體內(nèi)性激素水平紊亂導致女性出現(xiàn)一系列臨床癥狀，如燥熱、失眠、情緒波動、骨量減少等。圍絕經(jīng)期是女性骨量丟失最多、最迅速的時期，在此期間，體內(nèi)雌激素水平仍在正常范圍，而促性腺激素處于高水平階段；到疾病中后期，雌激素缺乏才是骨量丟失的主要原因[9]。因此，近年來有大量研究證明，在圍絕經(jīng)期促性腺激素與骨量之間存在一定相關(guān)性[10-11]。Liu等[12]在研究FSH多克隆抗體對去卵巢小鼠脂肪組織的影響時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH抗體與受體結(jié)合后還會增加小鼠骨量，推測FSH受體可能是治療絕經(jīng)后肥胖及骨質(zhì)疏松的潛在靶標，該研究與Ji等[13]的實驗結(jié)果一致。Wang等[14]在觀察圍絕經(jīng)期婦女FSH與破骨細胞活性標志物I型膠原肽羧基端交聯(lián)肽（C-terminal cross-linked telopetides of type I collagen，CTX）的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，圍絕經(jīng)期間女性FSH與CTX都顯著升高，提示高水平的FSH能促進破骨細胞活性，導致骨量丟失。LH是雌激素水平降低后負反饋刺激HPOA軸分泌的另一種激素，Blair等[15]實驗證明，降低血清LH水平后會引起去卵巢大鼠骨密度增加。大量實驗研究都已驗證HPOA軸中的促性腺激素對骨質(zhì)疏松有直接調(diào)控作用，可能這也是臨床中補充雌激素后導致體內(nèi)促性腺激素水平降低，對破骨細胞促進作用減弱，從而防治骨質(zhì)疏松的機制之一。本研究表明，二十五味鬼臼丸顯著降低血清LH、FSH、GnRH水平，增加遠端股骨密度，該結(jié)果與Zhou等[16]和Wong等[17]的結(jié)果一致，提示HPOA軸可能參與骨代謝。同時二十五味鬼臼丸選擇性上調(diào)下丘腦、垂體ERα表達，推測二十五味鬼臼丸可能通過與ERα結(jié)合降低血清LH、FSH、GnRH水平，從而間接調(diào)控骨密度。

骨組織同樣能夠表達ER，雌激素可直接作用于骨組織ER調(diào)控骨細胞（破骨細胞和成骨細胞）活性，進而控制骨量變化。針對這一機制，選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑成為臨床研究熱點，巴多昔芬是該類藥物代表之一，已有大量實驗長期研究其安全性及有效性，實驗證明巴多昔芬通過結(jié)合雌激素受體能有效增加骨密度，降低骨折發(fā)生率，并減少不良反應的發(fā)生[18-20]。植物雌激素由于與雌激素有共同的酚環(huán)結(jié)構(gòu)，因此能夠與ER結(jié)合發(fā)揮相同效應，并具有雙重調(diào)節(jié)作用，被認為具有選擇性ER調(diào)節(jié)作用。近年來由于臨床常規(guī)治療方法的遠期并發(fā)癥較多，植物雌激素成了研究對象，其治療PMOP的有效性在各實驗中早已得到了驗證[21-22]。ERβ在骨組織中分布廣泛，有研究表明ERβ多態(tài)性與高骨密度相關(guān)[23]。Lee等[24]研究雷公藤的多糖提取物對去卵巢小鼠更年期癥狀的影響時發(fā)現(xiàn)，雷公藤多糖提取物是通過調(diào)節(jié)ERβ而不是ERα相關(guān)的蛋白激酶B（protein kinase，Akt）信號通路減輕PMOP。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，二十五味鬼臼丸組顯著上調(diào)大鼠股骨ERβ的表達，結(jié)果提示二十五味鬼臼丸可能通過ERβ直接調(diào)控骨密度。

綜上所述，藏藥二十五味鬼臼丸對防治PMOP有一定作用，能有效改善絕經(jīng)后骨密度下降及骨微結(jié)構(gòu)紊亂，其機制可能與藥物作用骨組織ER后直接調(diào)控骨密度，或作用HPOA軸靶器官相關(guān)ER后通過改變體內(nèi)性激素的水平間接調(diào)控骨代謝有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突