孫博 蒙藝靈 溫濤 孟潔 劉健 許海燕

0 引言

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，乳腺癌已取代肺癌成為全球第一大癌癥[1]。乳腺癌的治療方式包括手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等[2]，其中靶向治療是一種有效的新型治療方案，具有特異性強(qiáng)、毒副作用相對(duì)較小的優(yōu)勢[3-4]。三陰性乳腺癌細(xì)胞雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和原癌基因Her-2均為陰性，缺乏靶向的受體，目前的靶向治療策略主要是通過開發(fā)其他潛在靶點(diǎn)，提高治療效果。靶向藥物如針對(duì)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的貝伐珠單抗可應(yīng)用于乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌等多種靶向治療，但因其治療乳腺癌過程中嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生率增加[5]，已被 FDA 撤銷其用于乳腺癌治療的適應(yīng)證。針對(duì)乳腺癌1號(hào)或2號(hào)基因(BRCA1/2)突變的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(polyADP-ribose polymerase,PARP)抑制劑奧拉帕利(Olaparib)和他拉唑帕利(Talazoparib)已經(jīng)被 FDA 批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性胚系乳腺癌突變、Her-2陰性乳腺癌，能較好地改善三陰性乳腺癌的無進(jìn)展生存期，但是對(duì)總生存期無明顯改善[6-7]。因此，開發(fā)其他三陰性乳腺癌的潛在靶點(diǎn)并進(jìn)行有效靶向治療具有重要意義。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌腫瘤組織高表達(dá)熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)[8-10]，因此HSP很有可能是一個(gè)潛在靶點(diǎn)。本研究將自主研發(fā)的靶向HSP60的多肽分子P17[11]連接到具有良好生物相容性、高光子熱轉(zhuǎn)換效率的金納米顆粒(aurum nanoparticle,AuNP)上，構(gòu)建了靶向光熱治療系統(tǒng)(AuNP-P17)，研究在激光照射下AuNP-P17對(duì)小鼠三陰性乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用，為乳腺癌的靶向治療提供一種新的靶向治療系統(tǒng)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑：檸檬酸鈉、氯金酸、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；FITC標(biāo)記的P17(國平藥業(yè)有限公司)；胎牛血清(Gibco公司)；改良型RPMI 1640培養(yǎng)基、青-鏈霉素(Hyclone公司)；小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；抗HSP60抗體、FITC標(biāo)記的驢抗兔的IgG(Cell Signaling Technology)；CCK-8 試劑盒(Dojindo Molecular Technologies，Inc)。

儀器：動(dòng)態(tài)光散射儀(Zetasizer Nano ZS90，Malvern instruments Ltd.)；紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)(Lambda 950，Perkin Elmer)；透射電子顯微鏡(TEM-1400 plus，JEOL Ltd.)；流式細(xì)胞儀(AccuriTMC6 flow cytometer，BD Biosciences)；激光器(MDL-HD，長春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司)。

1.2 金納米顆粒的制備

使用檸檬酸鈉還原氯金酸的方法制備金納米顆粒[12]。將150 mL檸檬酸鈉(2.2 mmol/L)加入到圓底燒瓶，90 ℃水浴下保持磁力攪拌，加入1 mL氯金酸(25 mmol/L)，反應(yīng)30 min后再加入1 mL 60 mmol/L檸檬酸鈉和1 mL 25 mmol/L氯金酸，反應(yīng)30 min后再加入1 mL 60 mmol/L檸檬酸鈉和1 mL 25 mmol/L氯金酸，反應(yīng)30 min后冷卻至室溫，即為AuNP溶液。

1.3 P17修飾金納米顆粒(AuNP-P17)的制備

在上述AuNP溶液中加入P17溶液，充分混勻，在30 ℃的水浴中避光孵育30 min。離心棄上清，向沉淀中加入超純水，超聲使沉淀完全分散，得到AuNP-P17溶液。

1.4 納米顆粒理化性質(zhì)表征

使用紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)檢測納米顆粒的吸收光譜。設(shè)置檢測波長為200～1100 nm，波長間隔為4 nm，在室溫下進(jìn)行。取1 mL AuNP溶液，通過離心濃縮后重懸到100 μL去離子水中，取5 μL溶液置于銅網(wǎng)上，通過透射電子顯微鏡觀察。將1 mL AuNP和AuNP-P17溶液，通過Zetasizer Nano ZS90分析儀測定顆粒的動(dòng)態(tài)光散射水合粒徑和Zeta電位。所有的測量均在室溫下進(jìn)行。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

4T1細(xì)胞培養(yǎng)于含有10 %胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃和5 %的CO2。細(xì)胞傳代比例為1∶5，大約每隔2 d傳一次代。選擇復(fù)蘇后傳代3～20次的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞活性分析

將4T1細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，貼壁后棄去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌2次，加不同濃度P17、AuNP和AuNP-P17，共孵育24 h后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗2次，每孔加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，1 h后吸取90 μL到酶標(biāo)板中，測量450 nm處的吸光度。每組設(shè)3個(gè)平行，只含有培養(yǎng)基和CCK-8組設(shè)為空白對(duì)照，未用材料處理的4T1細(xì)胞活性設(shè)為100%。

當(dāng)使用激光照射時(shí)，將4T1細(xì)胞與金原子濃度為100 μg/mL的AuNP和AuNP-P17孵育24 h(對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基)，棄去培養(yǎng)基，重新加入100 μL完全培養(yǎng)基。將激光器功率調(diào)整為1.922 W/cm2，照射時(shí)間為0 min、2 min、4 min和6 min。照射完畢立即使用便攜式熱電偶溫度計(jì)測定溶液中心溫度，棄去培養(yǎng)液，加入CCK-8工作液，1 h后吸取90 μL到酶標(biāo)板中，測量450 nm處的吸光度。每組設(shè)3個(gè)平行，將只含有CCK-8試劑和完全培養(yǎng)基的組設(shè)置為空白對(duì)照，激光照射0 min處理的4T1細(xì)胞的活性均設(shè)置為100 %。

1.7 檢測細(xì)胞HSP60的表達(dá)

將4T1細(xì)胞收集到1.5 mL離心管中。離心棄上清，PBS再洗滌1次。向細(xì)胞沉淀中，分別加入PBS或抗HSP60抗體(用PBS稀釋200倍)，4℃下孵育40 min。用PBS洗滌2次，再加入FITC標(biāo)記的驢抗兔的IgG二抗，在4 ℃避光孵育30 min。用PBS洗滌2次后，每管加入200 μL的細(xì)胞懸液，過300目網(wǎng)篩，用流式細(xì)胞儀檢測FITC的熒光強(qiáng)度。每組均設(shè)置3管平行，將PBS處理組設(shè)置為對(duì)照組，抗HSP60抗體處理組設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組。

1.8 檢測P17與細(xì)胞的結(jié)合

將4T1細(xì)胞收集到1.5 mL離心管中。離心棄上清，PBS再洗滌1次。向細(xì)胞沉淀中，分別加入200 μL的PBS或2 μmol/L的P17，混合均勻，在37℃條件下孵育2 h。然后用PBS洗滌2次，每管加入200 μL的PBS分散細(xì)胞。最后，過300目的網(wǎng)篩，用流式細(xì)胞儀檢測P17所標(biāo)記的FITC的熒光強(qiáng)度并分析P17與4T1細(xì)胞表面的結(jié)合。每組均設(shè)置3管平行，將PBS處理組設(shè)置為對(duì)照組，P17處理組設(shè)置為實(shí)驗(yàn)組。

1.9 光學(xué)顯微鏡下觀察納米顆粒與4T1細(xì)胞的結(jié)合

將4T1細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種至12孔板，貼壁后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌兩次，加入1 mL的AuNP或AuNP-P17(材料用完全培養(yǎng)基稀釋，金原子濃度均為100 μg/mL)，對(duì)照組加入1 mL的完全培養(yǎng)基。放置于培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)4 h和8 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，吸除材料，用PBS洗滌3次，加入新鮮培養(yǎng)基，放置于倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性通過采用SPSS 17.0的獨(dú)立兩樣本t檢驗(yàn)分析，以及單因素和雙因素重復(fù)測量的方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示(mean±SD)。P小于0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，n=3)。

2 結(jié)果

2.1 納米顆粒表征

通過紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)檢測制備得到的AuNP，可見其等離激元共振吸收峰在528 nm[圖1(a)]。利用透射電子顯微鏡觀察AuNP，可見金納米顆粒呈圓球形[圖1(b)]。通過動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)檢測金納米顆粒修飾前后的粒徑和Zeta電勢(表1)，結(jié)果顯示，金納米顆粒表面連接P17后，平均粒徑從(51.8±0.1)nm變?yōu)?52.1±2.2)nm，配對(duì)t檢驗(yàn)顯示P=0.866。Zeta電勢從(-29.3±0.3)mV變?yōu)?-29.6±0.6)mV，配對(duì)t檢驗(yàn)顯示P=0.395。

圖1 金納米顆粒的紫外-可見-近紅外吸收光譜

表1 AuNP和AuNP-P17的粒徑和Zeta電勢

2.2 乳腺癌細(xì)胞4T1中HSP60的表達(dá)

使用流式細(xì)胞儀檢測4T1細(xì)胞中HSP60的表達(dá)和與P17的結(jié)合，結(jié)果顯示，4T1細(xì)胞中顯著高表達(dá)HSP60[圖2(a)]，P17可以與HSP60顯著性高結(jié)合[圖2(b)]。

圖2 4T1細(xì)胞中HSP60的表達(dá)(a)和P17與HSP60的結(jié)合(b)

2.3 P17和納米顆粒對(duì)4T1細(xì)胞活性的影響

利用流式細(xì)胞儀考察P17對(duì)4T1細(xì)胞的影響。細(xì)胞活性結(jié)果表明，P17在20 μmol/L范圍內(nèi)對(duì)4T1細(xì)胞活性幾乎沒有影響[圖3(a)]。使用不同濃度AuNP和AuNP-P17與4T1細(xì)胞共孵育時(shí)，結(jié)果表明，在金原子濃度不超過100 μg/mL時(shí)，兩種納米顆粒對(duì)4T1細(xì)胞活性均無顯著影響[圖3(b)]。

圖3 不同濃度的P17(a)、AuNP和AuNP-P17(b)對(duì)4T1細(xì)胞活性的影響

2.4 乳腺癌細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取

通過光學(xué)顯微鏡直接觀察細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境及細(xì)胞狀態(tài)的改變。如圖4所示，在4 h和8 h時(shí)，AuNP處理組與對(duì)照組的溶液顏色無明顯變化，而AuNP-P17處理組的細(xì)胞及其周圍均可見紅色覆蓋，通過光學(xué)顯微鏡圖觀察，可見有明顯的顆粒存在于細(xì)胞。

圖4 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1與金納米顆粒孵育4 h和8 h時(shí)的光學(xué)顯微鏡圖

2.5 金納米顆粒對(duì)4T1細(xì)胞的靶向光熱殺傷作用

與金納米顆粒共孵育后的細(xì)胞在激光照射時(shí)的溫度變化見表2。結(jié)果顯示，AuNP-P17處理組在激光照射4 min后，細(xì)胞培養(yǎng)基的溫度從(22.9±0.4)℃升高到(52.0±3.9)℃；對(duì)于AuNP處理組，細(xì)胞培養(yǎng)基的溫度只升高到(47.2±0.6)℃，而對(duì)照組僅升溫到(38.2±2.4)℃。通過檢測4T1細(xì)胞在激光照射后的活性，可以看到AuNP-P17處理組在激光照射4 min時(shí)，細(xì)胞活性已降低到(1.3±2.8)%，AuNP處理組的細(xì)胞活性降低到了(64.1±6.8)%，而對(duì)照組細(xì)胞的活性與無激光照射相差不大，細(xì)胞活性為(100.0±3.2)%。各組之間兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

圖5 與金納米顆粒共孵育后的4T1細(xì)胞在激光照射不同時(shí)間時(shí)的相對(duì)活性

表2 4T1細(xì)胞在不同孵育條件下激光照射后的溫度

3 討論

檸檬酸鈉是制備金納米顆粒最常用的還原劑和穩(wěn)定劑，通過調(diào)節(jié)檸檬酸鈉的濃度，可制備不同粒徑的單分散金納米球形顆粒[12]。入射光電磁場可引起金納米顆粒表面自由電子的集體振蕩，并且在特定光波長處達(dá)到最大振蕩幅度，即表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)。制備得到的檸檬酸鈉包被AuNP溶液呈現(xiàn)紅色。通過對(duì)修飾P17前后的金納米顆粒進(jìn)行DLS表征，發(fā)現(xiàn)金納米顆粒修飾前后的粒徑和電勢區(qū)別不大(P> 0.05)，表明P17的修飾并不影響金納米顆粒的穩(wěn)定性。

熱休克蛋白是細(xì)胞在應(yīng)激條件下產(chǎn)生的一組高度保守的蛋白質(zhì)，研究表明，腫瘤細(xì)胞中HSP60通常會(huì)高表達(dá)[13]。P17是一種靶向HSP60蛋白的多肽分子，可以與細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的HSP60高效結(jié)合，生物相容性良好，且可在動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用[11]。由于4T1細(xì)胞中HSP60高表達(dá)且與P17強(qiáng)結(jié)合(圖2)，因此P17對(duì)4T1細(xì)胞具有強(qiáng)靶向性，可用于靶向4T1細(xì)胞系統(tǒng)的構(gòu)建。不同濃度的P17、AuNP和AuNP-P17與4T1細(xì)胞孵育后對(duì)細(xì)胞活性影響很小(圖3)，表明P17、AuNP和AuNP-P17具有良好的生物相容性。光學(xué)顯微鏡觀察表明，4T1細(xì)胞對(duì)修飾了P17的納米顆粒AuNP-P17具有更強(qiáng)的攝取能力，與流式檢測和分析結(jié)果一致。

光熱療法作為一種新的腫瘤治療方法，具有高選擇性和低副作用的優(yōu)點(diǎn)。金納米顆粒因具有高光子熱轉(zhuǎn)換效率，是良好的光熱治療載體[14-15]。通過檢測與材料孵育后的細(xì)胞在激光照射時(shí)的溫度變化(表2)，說明AuNP-P17處理組具有更高的升溫效率。將此光熱效應(yīng)運(yùn)用到殺傷腫瘤細(xì)胞，通過檢測4T1細(xì)胞在激光照射后的活性，結(jié)果證明AuNP-P17可以顯著性促進(jìn)對(duì)4T1細(xì)胞的殺傷。

4 結(jié)論

本研究基于乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)HSP60這一特征，將靶向HSP60的多肽P17與具有高光熱轉(zhuǎn)換的金納米顆粒相結(jié)合，構(gòu)建了靶向乳腺癌細(xì)胞4T1的光熱殺傷系統(tǒng)AuNP-P17，該系統(tǒng)細(xì)胞毒性低，具有良好的生物相容性，并促進(jìn)了細(xì)胞的攝取。與AuNP-P17共孵育后的4T1細(xì)胞在激光照射下溫度顯著升高，表明AuNP-P17具有靶向性和光熱效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)4T1細(xì)胞的高效殺傷，為其進(jìn)一步用于光熱治療研究奠定了基礎(chǔ)。