李向楠, 吳振興, 陳堅(jiān)劍, 郭國(guó)錦,梅高甫, 王 劍, 呂桂華*,

(1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 玉米與特色旱糧研究所，浙江 東陽(yáng) 322100；2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所，杭州 310021；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 公共實(shí)驗(yàn)室，杭州 310021)

硝磺草酮 (圖式1) 屬于三酮類除草劑，通過抑制4-羥基苯基丙酮酸雙加氧酶 (HPPD) 發(fā)揮作用[1]。在植物中HPPD 是酪氨酸分解代謝和質(zhì)體醌生物合成途徑的關(guān)鍵酶，HPPD 將酪氨酸轉(zhuǎn)化為質(zhì)體醌和α-生育酚[2]。質(zhì)體醌參與光合作用中光系統(tǒng)II 到光系統(tǒng)I 的電子傳遞，并作為類胡蘿卜素合成途徑的關(guān)鍵酶番茄紅素去飽和酶的輔助因子[3]。α-生育酚具有抗氧化功能，對(duì)植物體內(nèi)活性氧的猝滅和清除具有重要作用。對(duì)硝磺草酮敏感的植物出現(xiàn)酪氨酸含量增加、類胡蘿卜素降低、葉片退綠、株高和鮮重降低等現(xiàn)象[4]。在水稻中，當(dāng)硝磺草酮施用量為125～704 g/hm2時(shí)，地上部鮮重減少10%～50%[5]。大豆苗后施用10%硝磺草酮懸浮劑后，植株上部復(fù)葉褪綠，藥害嚴(yán)重時(shí)復(fù)葉干枯，植株萎蔫[6]。硝磺草酮對(duì)玉米具有選擇性，同時(shí)施用量低，土壤殘留少，對(duì)環(huán)境和后茬作物安全，在玉米種植過程中被廣泛應(yīng)用。但隨著玉米品種的增加和硝磺草酮的推廣使用，目前已有部分鮮食玉米品種表現(xiàn)出藥害，因此，有必要了解硝磺草酮在鮮食玉米體內(nèi)的代謝解毒機(jī)制。

硝磺草酮作為內(nèi)吸型選擇性除草劑，其對(duì)玉米的選擇性依賴于較慢的吸收和快速的代謝。對(duì)玉米、狗尾草、藜和牽牛葉面噴施C14標(biāo)記的硝磺草酮，24 h 后葉片中分別檢測(cè)到45%、61%、90%和55%放射性標(biāo)記，7 d 后玉米和狗尾草中檢測(cè)到的放射性硝磺草酮含量分別為0.000 8 和0.29 μg/g[2]。與普通玉米相比，鮮食玉米特別是具有se和sh2胚乳突變基因的甜玉米，發(fā)芽率低和幼苗長(zhǎng)勢(shì)弱，更易受到除草劑藥害影響，并因雜草競(jìng)爭(zhēng)而減產(chǎn)[7]。O'sullivan 等評(píng)估9 個(gè)甜玉米品種對(duì)硝磺草酮的抗性，當(dāng)苗后硝磺草酮施用量為200 g/hm2時(shí)，‘Calico Belle’和‘Del Monte 2038’均表現(xiàn)出明顯藥害，其中‘Del Monte 2038’的株高降低17%，產(chǎn)量降低28%[8]。張宏軍等調(diào)查了4 個(gè)煙嘧磺隆敏感型玉米品種對(duì)硝磺草酮的響應(yīng)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著施藥量的增加，光合效率顯著降低，其中白糯6 號(hào)降幅最大，且在施藥10 d 后才能恢復(fù)到正常水平；此外，4 個(gè)玉米品種的株高和鮮重均明顯降低[9]。由此可見，不同鮮食玉米品種對(duì)硝磺草酮的響應(yīng)差異，導(dǎo)致鮮食玉米生產(chǎn)過程中除草劑的應(yīng)用受到限制，但對(duì)其耐藥性機(jī)制的研究較少[2]。

RNA-Seq 利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行直接測(cè)序，在提供全基因組信息、檢測(cè)新轉(zhuǎn)錄本、等位基因特異性表達(dá)等方面均具有優(yōu)勢(shì)。目前RNA-Seq 已經(jīng)成功應(yīng)用于植物對(duì)除草劑耐受性的分子機(jī)制研究中。例如在牛筋草中，鑒定到28個(gè)與多胺、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因，作為百草枯抗性的候選基因[10]。在水麻中，鑒定到除草劑靶基因，并對(duì)其中的HPPD、GS、EPSPS 和ALS 酶基因進(jìn)行了序列分析[11]。在抗除草劑的稗中，鑒定出8 組除草劑靶位點(diǎn)基因和4 組非靶位點(diǎn)基因，作為參與除草劑抗性進(jìn)化的潛在候選基因[12]。在水稻中，鑒定到可能參與二氯喹啉酸響應(yīng)和解毒的基因，包括生長(zhǎng)素相關(guān)基因GH3和OsIAAs，解毒相關(guān)家族基因細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、UGT、堿性磷酸酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[13]。在玉米中，鑒定到13 個(gè)可能參與煙嘧磺隆代謝的候選基因，它們?cè)谀蜔熰谆锹〉挠衩鬃越幌抵酗@著高表達(dá)[14]。本研究利用RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組分析來(lái)鑒定玉米硝磺草酮代謝中可能涉及的重要基因。這些基因可以作為潛在的候選基因來(lái)解釋玉米對(duì)硝磺草酮的代謝形成機(jī)制，并為提高作物對(duì)三酮類除草劑的耐藥性提供發(fā)展策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試玉米品種為耐性玉米自交系301 (T)和敏感玉米自交系276 (S)，由浙江省農(nóng)科院玉米與特色旱糧研究所自主選育而成。75% 硝磺草酮水分散粒劑 (mesotrione WG，安徽中山化工有限公司)；超氧陰離子含量檢測(cè)試劑盒 (BC1295，索萊寶生物科技有限公司 )；過氧化氫含量檢測(cè)試劑盒(BC3595，索萊寶生物科技有限公司)；植物RNA 提取試劑盒 (DP432，天根生化科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (TaKaRa，日本)；熒光定量試劑盒 (TaKaRa，日本)；丙酮 (分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；氯仿和次氯酸鈉溶液(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；無(wú)水乙醇(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán))。

ES120 電子天平 (廈門萊斯德儀器有限公司)；TGL-16M 冷凍離心機(jī) (山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；EJ60 小型罐裝噴壺 (電壓10.8 V，流速7.15 mL/s，Evika, 蘇州嘉達(dá)園林工具有限公司)；UV-2000 分光光度計(jì) (UNICO，美國(guó))；葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng) (Plant Explorer，荷蘭)；艾本德移液器(100～1 000 μL，德國(guó)艾本德股份公司)；Light Cycler 480II real-time PCR system (Roche, 瑞士)；Agilent 2100 生物分析儀 (安捷倫科技公司，德國(guó))。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試藥劑為75%硝磺草酮水分散粒劑，試驗(yàn)前用水溶解，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果施藥劑量設(shè)為有效成分250 g/hm2。在玉米幼苗 3～5 葉期，采用莖葉噴霧法施藥，藥劑用量為250 g/hm2，同時(shí)設(shè)清水對(duì)照，每處理 3 次重復(fù)。

1.2.1 田間試驗(yàn) 試驗(yàn)于2020 年在浙江省農(nóng)科院玉米與特色旱糧研究所進(jìn)行 (29.16°N，120.13°E)，以本研究所自主選育的硝磺草酮耐性玉米自交系301 (T)和敏感玉米自交系276 (S)為材料。土壤為黏性土壤，肥力中等，其中有機(jī)質(zhì) 15.4 g/kg， 全氮 1.66 g/kg，堿解氮 120.6 mg/kg，速效磷 7.08 mg/kg，速效鉀 86.5 mg/kg。采用裂區(qū)設(shè)計(jì)， 硝磺草酮處理為主區(qū)，品種為副區(qū)。選取健康完整的玉米種子，直播于大田，行長(zhǎng) 3 m，行距 0.6 m，8 行區(qū)，3 次重復(fù)。小區(qū)面積 14.4 m2。田間管理措施與大田相同。

1.2.2 盆栽試驗(yàn) 選取健康完整的玉米種子，經(jīng)清水沖洗后用體積分?jǐn)?shù) 75% 的乙醇消毒 1 min，用體積分?jǐn)?shù)為 2%的次氯酸鈉溶液消毒 8 min，然后用去離子水沖洗 3 次，直播于裝有營(yíng)養(yǎng)土的 6孔苗盤中，每孔播1 粒種子，置于溫室大棚培養(yǎng)至3～5 葉期供試。

田間玉米幼苗分別于施藥后 2、3、7 和 14 d采集處理組和對(duì)照組幼苗葉片，液氮速凍后于-80 ℃保存，用于活性氧產(chǎn)生速率、過氧化氫含量的測(cè)定，以及后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

苗盤中玉米幼苗分別于施藥后0、1、2、3、4、5 和 6 d，取長(zhǎng)勢(shì)相近的玉米幼苗用于葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定。

1.3 不同玉米自交系的耐藥性分析

1.3.1 超氧陰離子產(chǎn)生速率和過氧化氫含量測(cè)定

超氧陰離子產(chǎn)生速率測(cè)定：稱取 0.1 g 玉米葉片，加入1 mL 樣品提取液 (試劑盒提供)，充分研磨后在4 ℃、 12 000 r/min 下離心 20 min，取上清液測(cè)定 530 nm 處吸光度值的變化，計(jì)算樣品中超氧陰離子 的產(chǎn)生速率。

過氧化氫含量測(cè)定：稱取 0.1 g 玉米葉片，加入 1 mL 丙酮，冰浴勻漿，于 8 000×g、 4 ℃ 下離心 10 min，取上清液測(cè)定415 nm 處的吸光度值，計(jì)算樣品中的H2O2含量。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定 分別取處理組和對(duì)照組幼苗進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定。儀器工作參數(shù)為：激發(fā)光強(qiáng)度 800 μmol/(m2·s)， 光化光強(qiáng)度100 μmol/(m2·s)，圖像采集速度 20 幀/s。

1.4 總RNA 提取

取硝磺草酮處理 48 h 的葉片提取總RNA，采用Agilent 2100 生物分析儀評(píng)估RNA 的完整性和總量，送北京諾禾致源公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.5 文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

取 12 個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序，包含耐性自交系對(duì)照組 (TC-1、TC-2、TC-3) 和處理組 (TT-1、TT-2、TT-3)，敏感自交系對(duì)照組 (SC-1、SC-2、SC-3) 和處理組 (ST-1、ST-2、ST-3)。利用待測(cè)序樣品的總RNA 構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)：首先，將Oligo(dT) 磁珠富集到的帶polyA 尾的mRNA 打斷成 300 bp 左右大小的片段；然后，以片段化的mRNA 為模板，隨機(jī)寡核苷酸為引物合成雙鏈cDNA；cDNA 經(jīng)過末端修復(fù)、添加測(cè)序接頭、PCR 擴(kuò)增和純化等過程，最終獲得文庫(kù)。

文庫(kù)質(zhì)檢合格后，進(jìn)行Illumina 測(cè)序，其基本原理是邊合成邊測(cè)序。在測(cè)序的flow cell 中加入 4 種熒光標(biāo)記的dNTP、DNA 聚合酶以及接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序儀捕獲熒光信號(hào)，獲得待測(cè)片段的序列信息。利用fastQC 軟件檢測(cè)原始數(shù)據(jù)的測(cè)序錯(cuò)誤率和GC 堿基含量分布[15]。利用NGSQC Toolkit 過濾原始數(shù)據(jù)，獲得Clean Reads 用于后續(xù)分析[16]。使用HISAT2 v2.0.5 軟件將clean reads 與玉米B73 參考基因組進(jìn)行比對(duì)，獲取其在參考基因組上的定位信息[17]。采用StringTie拼接轉(zhuǎn)錄本并進(jìn)行新基因預(yù)測(cè)[18]。

1.6 差異表達(dá)基因篩選及功能富集分析

利用Subread 軟件中的featureCounts 計(jì)算映射到每個(gè)基因的讀數(shù)，根據(jù)基因長(zhǎng)度計(jì)算每個(gè)基因的FPKM(expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced)[19]。運(yùn)用DESeq2 軟件進(jìn)行不同比較組合間的差異表達(dá)分析，以|log2(Fold Change)| ＞ 0和padj ≤ 0.05 作為差異表達(dá)基因 (DGEs) 的顯著閾值[20]。利用Cluster Profiler 軟件對(duì)不同比較組合間的差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能注釋(GO)和京都基因與基因組百科全書 (KEGG) 富集分析，以padj ≤ 0.05 作為顯著性富集的閾值。

1.7 候選基因分析

根據(jù)TC vs TT 及SC vs ST 獲得的共同差異表達(dá)基因，按照差異倍數(shù)大于2、padj ≤ 0.05 進(jìn)行篩選，結(jié)合基因功能注釋信息，選取對(duì)照和處理(TC vs TT, SC vs ST) 條件下基因表達(dá)差異性較大的基因，作為鮮食玉米自交系不同耐藥性的潛在候選基因。 以RNA-Seq 測(cè)序返還的耐性自交系對(duì)照組 (TC- 1、TC-2、TC-3) 和處理組 (TT-1、TT-2、TT-3)， 敏感自交系對(duì)照組 (SC-1、SC-2、SC-3) 和處理組 (ST-1、ST-2、ST-3) 的葉片RNA 為模板，合成cDNA。利用MazieGDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://maizegdb. org/) 獲取基因的CDS 序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)Quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR) 引物 (表1)。按照熒光定量試劑盒說明配制qRT-PCR 反應(yīng)體系，PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，1 個(gè)循環(huán)； 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，1 個(gè)循環(huán)。以GAPDH (Gene IDZm00001d049641)作為內(nèi)參基因，3 次重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法為 2-△△CT[21]。運(yùn)用Dunnett’s tests 和Student’st-tests 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 qRT-PCR 的引物序列Table 1 List of primers used for the qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 硝磺草酮處理對(duì)鮮食玉米的影響

在玉米3～5 葉期進(jìn)行硝磺草酮處理，以分析耐性和敏感玉米自交系對(duì)硝磺草酮的響應(yīng)。結(jié)果表明：250 g/hm2硝磺草酮處理7 d 后，敏感玉米自交系處理組植株葉片白化，部分葉片基部大面積褪綠。14 d 后敏感玉米自交系處理組植株均干枯死亡，而對(duì)照組植株正常生長(zhǎng) (圖1 a, b)。耐性玉米自交系處理組植株未見明顯損傷，14 d 后耐性玉米自交系處理和對(duì)照的生長(zhǎng)情況相近 (圖1 c, d)。

2.1.1 超氧陰離子 由圖2a 可知，僅在硝磺草酮處理后的第3 天，耐性自交系TT 的超氧陰離子產(chǎn)生速率比對(duì)照TC 增加15.29%，差異達(dá)到顯著水平，到第7 天比對(duì)照TC 增加4.43%。敏感自交系ST 的超氧陰離子產(chǎn)生速率在硝磺草酮處理后第3 天比對(duì)照SC增加4.29%，到第7 天比對(duì)照增加13.50% (圖2b)。硝磺草酮處理2 d 后，耐性自交系TT 的超氧陰離子產(chǎn)生速率在0.023 3～0.026 8 μmol/(g·min FW) 之間，平均為0.024 8 μmol/(g·min FW)；敏感自交系ST 的超氧陰離子產(chǎn)生速率在0.029 5～0.030 6 μmol/(g·min FW)之間 ，平均為0.030 3 μmol/(g·min FW)；敏感自交系ST 比耐性自交系TT 的超氧陰離子產(chǎn)生速率平均高21.9%。以上表明，硝磺草酮處理7 d 后，敏感自交系ST 的活性氧積累量顯著增加，嚴(yán)重破壞了植物體內(nèi)的氧化還原平衡。

2.1.2 過氧化氫 硝磺草酮處理后，不同耐性自交系中的H2O2含量變化如圖2 c, d 所示。相比于耐性自交系對(duì)照TC，硝磺草酮處理后第2 天、第3 天和第7 天，TT 的H2O2含量分別增加了106.9%、95.88%和121.4%，差異均達(dá)到顯著水平。相比與敏感自交系對(duì)照SC，硝磺草酮處理后第2 天、第3 天和第7 天，ST 的H2O2含量分別增加了97.35%、38.02%和105.8%，差異均達(dá)到顯著水平。然而，不同耐性自交系經(jīng)硝磺草酮處理后，H2O2含量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，敏感自交系ST 的H2O2含量隨著處理后時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，而耐性自交系TT 中H2O2呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。以上表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，硝磺草酮對(duì)敏感自交系造成的氧化損傷更加嚴(yán)重。

2.1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù) 最大光化學(xué)效率 (Fv/Fm)即PSII 反應(yīng)中心最大光化學(xué)轉(zhuǎn)化效率，反映植物葉片的光化學(xué)轉(zhuǎn)化效率和潛在活性。硝磺草酮處理導(dǎo)致玉米敏感自交系 ST 的Fv/Fm 持續(xù)下降，與對(duì)照SC 相比，施藥后0～6 d，ST 的Fv/Fm 分別下降6.6%、17.6%、29.2%、74.4%、66.1%、68.2%和78.3%，差異達(dá)到顯著水平；硝磺草酮處理導(dǎo)致耐性自交系 TT 的Fv/Fm，在噴藥后的第2 天、第3 天和第4 天，分別下降22.6%、15.4%和16.5%，差異達(dá)到顯著水平，然而在噴藥后的第5 天和第6天，TT 的Fv/Fm 恢復(fù)到與對(duì)照 (TC) 相近 (圖3a)的水平。Fv/Fm 的測(cè)定結(jié)果表明，耐性自交系能夠忍受硝磺草酮處理帶來(lái)的損傷，較快恢復(fù)光合能力。

非循環(huán)光合電子傳遞速率 (ETR) 反映實(shí)際光強(qiáng)條件下的表觀電子傳遞效率，它與光合速率之間具有很強(qiáng)的線性關(guān)系。如圖3b 所示，硝磺草酮處理后，敏感自交系ST 的ETR 持續(xù)下降，與對(duì)照SC 相比，0 ～ 6 d 內(nèi)ST 的ETR 分別下降6.1%、11.5%、27.5%、73.9%、63.1%、66.7%和80.5%，差異達(dá)到顯著水平。硝磺草酮處理后，耐性自交系TT 的ETR 呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，與對(duì)照相比，在噴藥后的第2 天、第3 天和第4 天，分別下降29.3%、25.1%和21.0%，差異達(dá)到顯著水平。然而在噴藥后的第5 天開始，TT 的ETR 上升到與TC 相近的水平。ETR 的測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步表明硝磺草酮嚴(yán)重抑制了敏感自交系葉片的光合作用。

2.2 RNA-seq 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

利用Illumina HiseqTM2500 高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)耐性玉米對(duì)照組 (TC-1、TC-2、TC-3) 和硝磺草酮處理組 (TT-1、TT-2、TT-3)，敏感玉米對(duì)照組 (SC-1、SC-2、SC-3) 和硝磺草酮處理組 (ST-1、ST-2、ST-3) 進(jìn)行測(cè)序，共獲得39 475 232 ～47 438 984 條原始序列 (raw reads)，去除接頭序列和低質(zhì)量堿基后得到高質(zhì)量序列 (clean reads)37 859 598 ～ 45 672 390 條，每個(gè)樣品中獲得6.40 ～6.85 Gb 的高質(zhì)量堿基 (clean bases)，其中質(zhì)量達(dá)到Q20 和Q30 的堿基比例分別超過97.84% 和93.80%。將RNA-Seq 獲得的高質(zhì)量序列與B73參考基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有86.45% ～ 89.74%的序列能夠比對(duì)到參考基因組上，其中能夠比對(duì)到基因組唯一位置的序列超過83.41%，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的質(zhì)量較高。樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性是檢驗(yàn)試驗(yàn)可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標(biāo)，根據(jù)樣本所有基因的FPKM 值計(jì)算組內(nèi)及組間樣本的相關(guān)性系數(shù)，4 個(gè)樣本的3 個(gè)重復(fù)間顯示出良好的相關(guān)性，皮爾森相關(guān)系數(shù)r均大于0.8 (圖4)。

2.3 硝磺草酮處理下敏感和耐性玉米的差異基因鑒定

根據(jù)樣本的所有基因表達(dá)水平 (FPKM)，以|log2(Fold Change)| ＞ 0 和padj ≤ 0.05 為篩選閥值，在所有樣品中共篩選到差異表達(dá)基因7 985個(gè)。在敏感玉米自交系中，處理和對(duì)照組間差異表達(dá)基因7 470 個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因4 020 個(gè)、下調(diào)表達(dá)基因3 450 個(gè)；在耐性玉米自交系中，處理和對(duì)照組間差異表達(dá)基因1 021 個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)基因526 個(gè)、下調(diào)表達(dá)基因495 個(gè) (圖5 a, b)。所有樣品中共同差異表達(dá)基因507 個(gè)，在ST vs S C 中下調(diào)表達(dá)基因2 1 0 個(gè)、上調(diào)表達(dá)基因297 個(gè)；在TT vs TC 中下調(diào)表達(dá)基因240 個(gè)、上調(diào)表達(dá)基因267 個(gè) (圖5 c, d)。以上表明硝磺草酮處理后敏感玉米自交系和耐性玉米自交系之間的基因響應(yīng)存在較大差異。

2.4 差異表達(dá)基因的GO 和KEGG 富集分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析，共有3 841個(gè)差異表達(dá)基因映射到GO 不同功能節(jié)點(diǎn)上，顯著富集在包括生物過程、細(xì)胞組分、分子功能的272 個(gè)亞類。在生物學(xué)過程類群中富集最顯著的條目為光合作用，共富集了123 個(gè)差異表達(dá)基因；在細(xì)胞組分類群中，類囊體是富集最顯著的條目，共富集了206 個(gè)差異表達(dá)基因；在分子功能類群，葉綠素結(jié)合為富集最顯著的條目，共富集到31 個(gè)差異表達(dá)基因 (圖6)。以上表明硝磺草酮處理對(duì)玉米葉片中的光合作用可產(chǎn)生較大影響。

將差異表達(dá)基因比對(duì)到KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得基因注釋信息以進(jìn)一步探索基因功能。結(jié)果顯示：共有1 136 個(gè)差異基因被注釋到KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)的112 條代謝路徑中。對(duì)富集度最高的20 條代謝路徑進(jìn)行展示 (圖7)，其中富集程度達(dá)到顯著水平 (padj ≤ 0.05) 的代謝通路有10 個(gè)：4 個(gè)與光合作用相關(guān)的代謝通路，包括光合作用-觸角蛋白(22 DEGs)、光合作用 (35 DEGs)、光合器官碳固定 (27 DEGs) 和卟啉與葉綠素代謝 (21 DEGs)；3 個(gè)與碳水化合物代謝相關(guān)通路，包括碳代謝 (90 DEGs)、淀粉與蔗糖代謝 (55 DEGs) 和糖酵解 (50 DEGs)；2 個(gè)氨基酸代謝通路，包括甘氨酸、絲氨酸與蘇氨酸代謝 (21 DEGs) 以及氨基酸的生物合成 (73 DEGs)；1 個(gè)脂類代謝相關(guān)通路，甘油磷脂代謝通路 (40 DEGs)。以上顯著富集到的代謝通路與光合作用、碳水化合物、氨基酸、脂類代謝等相關(guān)，涉及了生命活動(dòng)的各個(gè)階段，表明這些代謝通路在玉米響應(yīng)硝磺草酮處理中可能具有重要作用。

2.5 硝磺草酮代謝相關(guān)基因的篩選與驗(yàn)證

細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 (GSTs)、檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物體內(nèi)除草劑代謝中發(fā)揮重要作用。根據(jù)基因功能注釋及基因的差異表達(dá)情況 (|log2(Fold Change)| ＞1)，共篩選到9 個(gè)可能參與玉米硝磺草酮代謝的重要基因，編碼的產(chǎn)物依次為：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素P450 家族72A 亞家族蛋白、細(xì)胞色素P450 家族709B 亞家族蛋白、酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶1、交替氧化酶2、線粒體內(nèi)選擇性NAD(P)H-泛醌氧化還原酶A1、脂氧合酶2、檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白、腺苷甲硫氨酸脫羧酶原酶 (表2)。

表2 硝磺草酮處理下篩選的9 個(gè)差異基因Table 2 The 9 DEGs screened under mesotrione treatment

利用qRT-PCR 檢測(cè)敏感和耐性玉米自交系處理組和對(duì)照組中這9 個(gè)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明：基因Zm00001d042099、Zm00001d044157、Zm00001d007462、Zm00001d002436、Zm00001d021804和Zm00001d042541均上調(diào)表達(dá);Zm00001d040764均下調(diào)表達(dá)；Zm00001d032828和Zm00001d020544在敏感自交系中下調(diào)表達(dá)，而在耐性自交系中上調(diào)表達(dá) (圖8)。9 個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，相關(guān)性系數(shù)r為0.85，具有線性關(guān)系。

3 討論

比較不同生長(zhǎng)環(huán)境、組織、器官和發(fā)育階段樣本間的基因表達(dá)差異是揭示特定分子機(jī)制的有效方法。本研究對(duì)硝磺草酮處理前后敏感和耐性玉米葉片的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)敏感玉米中差異表達(dá)基因數(shù)目為耐性玉米差異表達(dá)基因數(shù)目的7.3 倍。在對(duì)煙嘧磺隆具有不同耐藥性的近等基因系中，敏感型玉米自交系檢測(cè)到2 100 個(gè)差異表達(dá)基因，而耐性玉米自交系中檢測(cè)到1 398 個(gè)差異表達(dá)基因，前者是后者的1.5 倍[14]。本研究與該結(jié)果相似，推測(cè)可能是由于除草劑對(duì)敏感型玉米自交系造成的損傷更嚴(yán)重，因此誘導(dǎo)了更多基因的差異表達(dá)。差異表達(dá)基因的GO 和KEGG 富集分析顯示，光合作用、類囊體和葉綠素是富集最顯著的GO 條目，光合作用-觸角蛋白、光合作用、光合器官碳固定和卟啉與葉綠素代謝是富集最顯著的代謝通路。這與硝磺草酮抑制植物類胡蘿卜素合成，導(dǎo)致葉片退綠，進(jìn)而抑制光合作用的藥害機(jī)理一致[4]。

前人的研究中，細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過調(diào)控基因表達(dá)來(lái)參與除草劑的非靶標(biāo)抗性，其中細(xì)胞色素P450氧化除草劑是植物主要代謝除草劑的途徑[23]。Zm00001d044157編碼細(xì)胞色素P450 72A 亞家族蛋白CYP72A123基因。在水稻和玉米中，細(xì)胞色素P45072A 亞家族蛋白CYP72A4、CYP72A5、CYP72A28和CYP72A31基因通過增強(qiáng)基因表達(dá)，參與乙酰乳酸合成酶抑制除草劑和磺酰脲類除草劑的代謝[14,24]。本研究中，硝磺草酮處理48 h 后，耐性和敏感玉米自交系中CYP72A123基因均顯著上調(diào)表達(dá)，表明該基因可能參與了硝磺草酮的代謝。Zm00001d040764編碼細(xì)胞色素P450 709B 亞家族蛋白CYP709B2。CYP450 709B 亞家族包括CYP709B1、CYP709B2和CYP709B3。在擬南芥中，C Y P 7 0 9 B 3基因通過上調(diào)表達(dá)，增強(qiáng)植物抵抗非生物脅迫的能力[25]。本研究中，硝磺草酮處理后，敏感和耐性玉米自交系中CYP709B2基因均下調(diào)表達(dá)，且敏感自交系中基因表達(dá)量下降更顯著，表明CYP709B2基因能夠響應(yīng)硝磺草酮處理。本研究中，共篩選到2 個(gè)可能參與硝磺草酮代謝的細(xì)胞色素P450 家族基因Zm00001d044157和Zm00001d040764，硝磺草酮處理后二者表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)模式，這可能是細(xì)胞色素P450酶家族功能復(fù)雜性所致。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶催化還原型谷胱甘肽的巰基與除草劑代謝物的親電子基團(tuán)偶聯(lián)，可提高除草劑代謝物的疏水性，使其更易于穿透細(xì)胞膜而被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，達(dá)到解除細(xì)胞毒性的目的[26]。經(jīng)煙嘧磺隆處理后，敏感和耐性玉米自交系中GST1和GSTU6基因均顯著上調(diào)表達(dá)[14]。本研究中，Zm00001d042099基因編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GST，硝磺草酮處理后敏感和耐性玉米中GST基因均顯著上調(diào)表達(dá)，表明該基因可能參與了硝磺草酮的代謝。酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (TAT) 催化酪氨酸合成4-羥基苯丙酮酸 (pHPP)，pHPP 在羥苯丙酮酸雙加氧酶 (HPPD)、羥基苯丙酮酸還原酶等一些列酶的催化下合成泛素、質(zhì)體醌和生育酚[27]。在擬南芥中至少有兩種同源的TAT 酶TAT1 和TAT2，TAT2 的催化活性和底物特異性遠(yuǎn)低于TAT1，TAT1 表達(dá)的減少分別導(dǎo)致酪氨酸和生育酚的積累增加和降低[28]。Zm00001d007462編碼酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (TAT1)，硝磺草酮處理后耐性和敏感玉米自交系中TAT1基因均上調(diào)表達(dá)，且耐性自交系中表達(dá)增強(qiáng)更顯著，表明TAT1基因可能通過促進(jìn)生育酚的合成，緩解硝磺草酮帶來(lái)的損傷。

交替氧化酶 (AOX) 是高等植物線粒體交替呼吸途徑的末端氧化酶，通過消耗電子傳遞鏈上過多的電子和減少活性氧的產(chǎn)生，在植物抵抗逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[29]。Zm00001d002436編碼交替氧化酶AOX2，硝磺草酮導(dǎo)致耐性玉米和敏感玉米中AOX2基因均顯著上調(diào)表達(dá)，表明該基因能夠響應(yīng)硝磺草酮的誘導(dǎo)。硝磺草酮處理后，植物體內(nèi)氧化損傷嚴(yán)重。AOX2基因可能通過降低玉米中的活性氧含量，參與硝磺草酮的代謝。線粒體呼吸鏈復(fù)合物I 位于線粒體內(nèi)膜，是呼吸鏈中最重要的蛋白復(fù)合體之一，通過電子傳遞形成跨膜質(zhì)子梯度，驅(qū)動(dòng)ATP 的合成[30]。Zm00001d021804編碼線粒體內(nèi)選擇性NAD(P)H-泛醌氧化還原A1，是植物線粒體呼吸鏈復(fù)合體I 的重要組成部分。硝磺草酮導(dǎo)致耐性和敏感玉米中Zm00001d021804基因均顯著上調(diào)表達(dá)，暗示其可能通過促進(jìn)能量代謝，緩解硝磺草酮帶來(lái)的氧化損傷。脂氧合酶(LOX) 是茉莉酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶，當(dāng)植物遭受生物和非生物脅迫時(shí)，LOX基因誘導(dǎo)表達(dá)，與植物抗逆相關(guān)的茉莉酸類物質(zhì)合成增加，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列抗逆相關(guān)基因的表達(dá)[31]。Zm00001d042541編碼脂氧合酶LOX2，硝磺草酮處理后耐性和敏感玉米中LOX2基因均上調(diào)表達(dá)，且在耐性自交系中表達(dá)量更高，暗示了該基因可能通過促進(jìn)抗逆性物質(zhì)合成，增強(qiáng)玉米對(duì)硝磺草酮的耐受性。

檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于多藥物和有毒化合物外排家族，是生物中5 類解毒輸出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族之一，其主要功能為次生代謝物的積累、重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[32]。Zm00001d032828編碼檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白，經(jīng)硝磺草酮處理后，耐性玉米中該基因的表達(dá)顯著上調(diào)，而敏感玉米中則顯著下調(diào)，自交系中基因表達(dá)模式的差異可能對(duì)除草劑的代謝效率產(chǎn)生影響。腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC) 是多胺代謝途徑的限速酶，其通過調(diào)控體內(nèi)多胺含量來(lái)參與植物逆境脅迫響應(yīng)。在擬南芥中，過表達(dá)SAMDC基因，多胺含量提高，植株抵抗非生物逆境脅迫的能力顯著增強(qiáng)[33]。Zm00001d020544編碼SAMDC，經(jīng)硝磺草酮處理后，耐性玉米中SAMDC基因上調(diào)表達(dá)，而在敏感玉米中下調(diào)表達(dá)，暗示了該基因可能通過上調(diào)表達(dá)，提高玉米對(duì)除草劑的耐藥性。

4 結(jié)論

本研究從生理學(xué)角度初步揭示了硝磺草酮對(duì)不同耐性的鮮食玉米自交系活性氧積累及光合作用的影響。利用RNA-Seq 分析了響應(yīng)硝磺草酮的耐性和敏感玉米自交系的轉(zhuǎn)錄組。初步篩選出9 個(gè)可能參與硝磺草酮代謝的差異表達(dá)基因：Zm00001d042099、Zm00001d044157、Zm00001d007462、Zm00001d002436、Zm00001d021804、Zm00001d042541、Zm00001d040764、Zm00001d032828和Zm00001d020544，這些基因編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素P450亞家族蛋白、酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、交替氧化酶、線粒體內(nèi)選擇性NAD(P)H-泛醌氧化還原酶、脂氧合酶、檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族蛋白和腺苷甲硫氨酸脫羧酶原酶。本研究結(jié)果將有助于了解玉米對(duì)硝磺草酮的代謝機(jī)制，可為挖掘除草劑代謝關(guān)鍵基因和認(rèn)識(shí)其功能提供依據(jù)。