程敬麗, 李安邦, 肖豆鑫, 趙金浩

(浙江大學(xué) 農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州 310058)

琥珀酸脫氫酶抑制 (SDHI) 類殺菌劑具有廣譜、高效、低毒和環(huán)境相容性好等優(yōu)點，迄今已有20 多個品種商品化[1]。通過分析現(xiàn)有SDHI 的分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其均含羧酸母核骨架、酰胺骨架和胺部分[2-3]，其中酰胺骨架高度保守，胺部分多為取代的芳香胺或者雜環(huán)胺，而羧酸母核骨架的結(jié)構(gòu)相對變化豐富[4]。從上市的品種來看，SDHI 類殺菌劑以取代的吡唑甲酰胺骨架結(jié)構(gòu)類型居多[5]。例如萎銹靈、氟酰胺、甲呋酰胺、噻氟酰胺、啶酰菌胺和氟唑菌酰胺，分別含有氧硫雜芑環(huán)、苯環(huán)、呋喃環(huán)、吡啶環(huán)、吡唑環(huán)和噻唑環(huán)等[6]。雖然已經(jīng)商品化的SDHI 類殺菌劑活性較高，但由于其骨架結(jié)構(gòu)變化小，導(dǎo)致其殺菌譜較窄，且很快產(chǎn)生交互抗性[7-8]，因此，迫切需要創(chuàng)制具備新穎骨架結(jié)構(gòu)的SDHI 類殺菌劑。

當(dāng)前，對SDHI 類殺菌劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的熱點在于側(cè)鏈胺取代基的修飾[9-12]，而對羧酸母核骨架和酰胺骨架的改造相對較少，如耿瑞等將叔醇結(jié)構(gòu)引入到吡唑羧酸的骨架中，具有一定的新穎性[13]。羧酸母核中含有吡唑的商品化品種已有11 個，吡唑環(huán)的引入大大增強了其殺菌活性，如氟唑菌酰胺、氟唑菌酰羥胺和苯并烯氟菌唑等[14]。2014 年商品化的異丙噻菌胺 (isofetamid) ，是由日本石原產(chǎn)業(yè)開發(fā)的一種新型噻吩酰胺類殺菌劑，也是唯一的羧酸母核中含噻吩結(jié)構(gòu)的SDHI 類產(chǎn)品[5]，其作為一種內(nèi)吸性殺菌劑，兼具預(yù)防和治療作用，用于防控菌核病和灰霉病等[15]。

骨架躍遷是先導(dǎo)優(yōu)化策略中常見的方法之一，通過骨架中某一部分的替換躍遷，不僅可以提高先導(dǎo)配體與受體的親和力[16-17]，改善先導(dǎo)化合物的穩(wěn)定性[18]，還可以降低先導(dǎo)化合物的毒性[19]、規(guī)避知識產(chǎn)權(quán)的保護(hù)等[20]。本課題組在前期研究中，在保留吡唑甲酰胺的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了一個具有新穎吡唑聯(lián)苯羧酸骨架的SDHI 類先導(dǎo)化合物A16C[21]。為進(jìn)一步優(yōu)化此先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，本研究通過骨架躍遷，將吡唑聯(lián)苯酰胺骨架中的苯環(huán)替換為異丙噻菌胺中的活性基團(tuán)噻吩，設(shè)計、合成了18個結(jié)構(gòu)新穎的噻吩吡唑甲酰胺類衍生物 (目標(biāo)化合物的設(shè)計策略見圖式1，合成路線見圖式2)，其中17 個化合物為首次報道。初步研究了該系列衍生物對植物病原真菌的殺菌活性，并利用分子對接方法初步研究了目標(biāo)化合物與琥珀酸脫氫酶(SDH)的結(jié)合模式，以期發(fā)現(xiàn)具有新穎骨架結(jié)構(gòu)的SDHI 類殺菌劑。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

AVANCE III 400-MHz 型核磁共振波譜儀(TMS 為內(nèi)標(biāo)，DMSO-d6為溶劑，瑞士布魯克公司)；6 530 Q-TOF 液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國安捷倫公司)；Quattro Premier XE 液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國Waters 公司)；RY-1g 熔點測定儀 (溫度計未校正，天津天光光學(xué)儀器有限公司)；H 型柱層析硅膠 (青島海洋化工廠)；所有溶劑和試劑均為分析純。

1.2 供試菌株

水稻立枯絲核菌Rhizoctonia solani、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani、草莓灰霉病菌Botrytis cinerea和水稻惡苗病菌Fusarium moniliforme，均為本研究所保存和提供。

1.3 化合物的合成[21]

1.3.1 4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酸 (中間體2-1) 的合成 將22.90 g 1-甲基-1H-吡唑-5-硼酸頻哪醇酯 (110 mmol)、22.1 g 4-溴噻吩-2-甲酸甲酯 (100 mmol)、26.67 g 磷酸三鉀 (三水合物)(100 mmol)、11.5 g 四 (三苯基膦) 鈀 (Pd(PPh3)4)(10 mmol) 和160 mLN,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 混合均勻，在氮氣保護(hù)下攪拌回流7 h。冷卻，用飽和氯化鈉水溶液(50 mL × 3) 洗滌，乙酸乙酯(60 mL × 3) 萃取，50 g 無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾得23.6 g 黃色固體 (100 mmol)。加入甲醇30 mL 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 %的氫氧化鈉溶液50 mL，常溫攪拌4.5 h 后減壓蒸餾，用乙酸乙酯(30 mL ×3) 洗滌，水相用體積分?jǐn)?shù)為8 %的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3～4，立即出現(xiàn)白色沉淀。抽濾，干燥，得到13.53 g 化合物 2-1。白色固體，產(chǎn)率65 %，m.p.189～191 ℃。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ:8.10 (d,J= 1.5, 1H), 7.94 (d,J= 1.5, 1H), 7.43 (d,J= 1.9, 1H), 6.54 (d,J= 1.9, 1H), 3.93 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 162.7, 137.9, 137.2,135.6, 133.1, 131.2, 130.4, 106.1, 38.0. HRMS(m/z,ESI-) 計算值 C9H8N2O2S-[M-H]-207.023 4, 實測值207.023 6。

1.3.2 4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基) 噻吩-2-甲酸 (中間體2-2) 的合成 參考文獻(xiàn)[22]的方法合成，得到白色固體，收率70 %，m.p. 194～197 ℃(文獻(xiàn)值[21]：m.p. 195～197 ℃，收率74 %)。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ: 8.11 (s, 1H), 7.93 (d,J= 1.6 Hz, 1H),7.84 (d,J= 1.5 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 3.84 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 163.0, 136.5,135.1, 134.4, 131.6, 128.3, 125.0, 117.0, 38.7.HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C9H8N2O2S-[M-H]-207.023 4,實測值207.023 5。

1.3.3 目標(biāo)化合物N-取代苯基-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺類化合物的合成通法 參考文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行。將化合物2-1 或2-2 溶于二氯甲烷中，滴加草酰氯 ((COCl)2)，在氮氣保護(hù)及室溫下攪拌2 h。降溫至0 ℃，分別滴加各種胺和三乙胺的混合物，升溫至室溫反應(yīng)2 h。滴加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至3～4，用飽和氯化鈉水溶液(25 mL × 3)洗滌、二氯甲烷(50 mL × 3) 萃取，減壓蒸餾，柱層析 (V(石油醚 ):V(乙酸乙酯) = 3 : 1)純化，分別制備得到目標(biāo)化合物3a～3n，4a～4d(其中4d 為已知物[22])。

N-(4-溴苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺(3a)：淡黃色固體，收率85.5 %, m.p. 162～163 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ: 10.41 (s, 1H), 8.23 (d,J= 1.3 Hz,1H), 8.12 (d,J= 1.4 Hz, 1H), 7.74 - 7.67 (m, 2H), 7.60 - 7.53(m, 2H), 7.48 (d,J= 1.9 Hz, 1H), 6.50 (d,J= 1.9 Hz, 1H),3.96 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 159.6, 140.4,138.0, 138.0, 137.4, 131.7, 131.0, 129.4, 129.4, 122.4, 115.8,105.9, 38.1. HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C15H11BrN3OS [M-H]-359.981 2, 實測值 359.981 4。

N-(4-溴-2-甲基苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺(3b)：淡黃色固體，收率79.2 %, m.p. 152～153 ℃;1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ: 10.07 (s, 1H), 8.21 (s, 1H),8.10 (d,J= 1.4 Hz, 1H), 7.53 (d,J= 1.9 Hz, 1H), 7.47 (d,J=1.9 Hz, 1H), 7.43 (dd,J= 8.4, 2.1 Hz, 1H), 7.30 (d,J= 8.5 Hz,1H), 6.50 (d,J= 1.9 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.24 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 159.7, 140.1, 138.0, 137.4,136.8, 135.2, 133.0, 131.0, 129.3, 129.1, 129.1, 128.7, 118.8,105.9, 38.1, 17.7. HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C16H13BrN3OS[M-H]-373.996 8, 實測值 373.998 4。

N-甲基-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-N-苯基噻吩-2-甲酰胺(3c)：淡黃色固體，收率82.6 %, m.p. 166～153 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ: 7.86 (d,J= 1.5 Hz, 1H), 7.52 - 7.39(m, 5H), 7.35 (d,J= 1.9 Hz, 1H), 6.60 (d,J= 1.3 Hz, 1H),6.16 (d,J= 1.9 Hz, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.36 (s, 3H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6),δ: 161.1, 143.9, 139.0, 137.8, 137.2,131.2, 130.0, 129.7, 128.6, 128.4, 128.2, 105.5, 38.7, 37.7.HRMS(m/z, ESI-) 計算值C16H14N3OS [M-H]-296.086 3, 實測值 296.086 5。

N-(4-氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺(3d)：白色固體，收率72.8 %, m.p. 192～193 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ: 10.42 (s, 1H), 8.23 (d,J= 1.4 Hz,1H), 8.11 (d,J= 1.1 Hz, 1H), 7.80-7.72 (m, 2H), 7.48 (d,J=1.9 Hz, 1H), 7.46 - 7.41 (m, 2H), 6.51 (d,J= 1.9 Hz, 1H),3.96 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 159.7, 140.4,138.0, 137.6, 137.4, 131.0, 129.4, 129.4, 128.8, 127.7, 122.0,105.9, 38.1. HRMS(m/z, ESI-) 計算值C15H11ClN3OS [M-H]-316.031 7, 實測值 316.031 9。

N-(2,5-二甲基苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺(3e)：灰褐色固體，收率70.1 %, m.p. 158～159 ℃;1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ: 9.99 (s, 1H), 8.21 (s, 1H),8.08 (d,J= 1.4 Hz, 1H), 7.47 (d,J= 1.9 Hz, 1H), 7.17 (d,J= 7.7 Hz,1H), 7.13 (s, 1H), 7.01 (d,J= 7.7 Hz, 1H), 6.50 (d,J= 1.9 Hz,1H), 3.96 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 2.19 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 159.6, 140.6, 138.0, 137.5, 135.5, 135.3,131.0, 130.8, 130.3, 128.9, 128.8, 127.3, 127.1, 105.8, 38.1,20.6, 17.6. HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C17H16N3OS [M-H]-310.102 0, 實測值 310.102 4。

N-(3-氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺(3f)： 白色固體，收率87.7 %. m.p. 170～171 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ: 10.45 (s, 1H), 8.25 (d,J= 1.4 Hz,1H), 8.13 (d,J= 1.3 Hz, 1H), 7.90 (t,J= 2.0 Hz, 1H), 7.70 -7.63 (m, 1H), 7.48 (d,J= 1.9 Hz, 1H), 7.41 (t,J= 8.1 Hz, 1H),7.23 - 7.15 (m, 1H), 6.51 (d,J= 1.9 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 160.2, 140.6, 140.5, 138.4,137.7, 133.5, 131.4, 131.0, 130.0, 129.9, 124.1, 120.3, 119.1,106.3, 38.5. HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C15H11ClN3OS [M-H]-316.031 7, 實測值 316.031 7。

4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-N-(對甲苯基) 噻吩-2-甲酰胺(3g)： 白色固體，收率82.3 %, m.p. 175～177 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ: 10.29 (s, 1H), 8.32 - 8.18 (m, 1H),8.07 (s, 1H), 7.62 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.47 (d,J= 1.8 Hz, 1H),7.17 (d,J= 8.3 Hz, 2H), 6.51 (d,J= 1.8 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H),2.28 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 159.4, 140.9,138.0, 137.5, 136.1, 133.1, 130.9, 129.2, 129.0, 120.6, 105.9,38.1, 20.6. HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C16H14N3OS [M-H]-296.086 3,實測值 296.086 5。

4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-N-(間甲苯基) 噻吩-2-甲酰胺(3h)： 白色固體，收率86.4 %, m.p. 172～173 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ: 10.29 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.09 (d,J= 1.3 Hz, 1H), 7.54 - 7.56 (m, 2H), 7.47 (d,J= 1.9 Hz, 1H),7.25 (t,J= 7.7 Hz, 1H), 6.95 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 6.51 (d,J=1.9 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H), 2.32 (s, 3H);13C NMR (101 MHz,DMSO-d6),δ: 159.5, 140.9, 138.5, 138.0, 137.9, 137.5, 131.0,129.1, 128.7, 124.7, 121.1, 117.7, 105.8, 38.1, 21.3. HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C16H14N3OS [M-H]-296.086 3, 實測值296.086 0。

N-(3-甲氧基苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰 (3i)：淺灰色固體，收率69.5 %, m.p.184～185 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ: 10.34 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.09 (s,1H), 7.52-7.45 (m, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.33 (d,J= 8.2 Hz,1H), 7.27 (t,J= 8.1 Hz, 1H), 6.71 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 6.51 (d,J= 1.5 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.76 (s, 3H);13C NMR (101 MHz,DMSO-d6),δ: 159.6, 159.6, 140.8, 139.8, 137.9, 137.4, 131.0,129.6, 129.2, 112.7, 109.6, 106.2, 105.9, 55.2, 38.1.HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C16H14N3O2S [M-H]-312.081 2, 實測值 316.081 3。

4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-N-苯基噻吩-2-甲酰胺 (3j)：淡黃色固體，收率77.6 %. m.p. 154～155 ℃;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ: 10.31 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.09 (d,J= 1.2 Hz,1H), 7.73 (d,J= 8.1 Hz, 2H), 7.48 (d,J= 1.7 Hz, 1H), 7.38 (t,J= 7.9 Hz, 2H), 7.13 (t,J= 7.4 Hz, 1H), 6.51 (d,J= 1.7 Hz,1H), 3.97 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 159.5,140.7, 138.6, 137.9, 137.4, 130.9, 129.1, 128.8, 124.1, 120.5,105.8, 38.1. HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C15H12N3OS [M-H]-282.070 7, 實測值 282.070 9。

4-(N-芐基-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺(3k)：淡黃色固體，收率78.2 %, m.p. 139～140 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ: 9.15 (t,J= 5.9 Hz, 1H), 8.07 (d,J=1.4 Hz, 1H), 8.01 (d,J= 1.4 Hz, 1H), 7.45 (d,J= 1.9 Hz, 1H),7.35 - 7.24 (m, 5H), 6.45 (d,J= 1.9 Hz, 1H), 4.49 (d,J= 6.0 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ:160.9, 140.6, 139.3, 137.9, 137.5, 130.9, 128.5, 128.3, 128.2,127.5, 127.0, 105.7, 42.7, 38.1. HRMS(m/z, ESI-) 計算值C16H14N3OS [M-H]-296.086 3, 實測值 296.086 5。

4-(N-(2-氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺 (3l)：淡黃色固體，收率83.5 %, m.p. 130～131 ℃;1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ: 10.27 (s, 1H), 8.27 (d,J=1.4 Hz, 1H), 8.11 (d,J= 1.4 Hz, 1H), 7.60 (td,J= 7.9, 1.5 Hz,1H), 7.47 (d,J= 1.9 Hz, 1H), 7.39 - 7.17 (m, 3H), 6.51 (d,J=1.9 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ:159.7, 139.8, 138.0, 137.4, 131.1, 129.5, 129.4, 127.3, 127.3,125.1, 125.0, 124.6, 124.5, 116.1, 115.9, 105.9, 38.1.HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C15H11ClN3OS [M-H]-316.031 7,實測值 316.032 2。

N-(4-氟苯基乙基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺 (3m)：淡黃色液體，收率90.1 %;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ: 8.69 (t,J= 5.3 Hz, 1H), 8.00 - 7.93 (m, 2H),7.45 (s, 1H), 7.31- 7.24 (m, 2H), 7.12 (t,J= 8.8 Hz, 2H), 6.44(s, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.51 - 3.40 (m, 2H), 2.85 (t,J= 7.3 Hz,2H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 160.8 (d,J=241.3 Hz), 160.6, 140.6, 137.8, 137.3, 135.4 (d,J= 3.1 Hz),130.6, 130.4 (d,J= 7.9 Hz), 127.9, 127.7, 115.0 (d,J=21.0 Hz), 105.5, 40.7, 37.9, 34.1. HRMS(m/z, ESI-) 計算值C17H15FN3OS [M-H]-328.092 5, 實測值 328.093 0。

N-(4-(叔丁基) 苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺 (3n)：淡黃色液體，收率82.8 %;1H NMR (400 MHz,DMSO-d6),δ: 9.09 (t,J= 5.9 Hz, 1H), 8.05 (d,J= 1.4 Hz,1H), 7.98 (d,J= 1.4 Hz, 1H), 7.43 (d,J= 1.9 Hz, 1H), 7.35 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.26 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 6.44 (d,J= 1.9 Hz,1H), 4.43 (d,J= 5.8 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 1.26 (s, 9H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 160.8, 149.5, 140.7, 137.9,137.6, 136.3, 130.9, 128.2, 128.1, 127.4, 125.2, 105.7, 42.5,38.1, 34.3, 31.3. HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C20H22N3OS [MH]-352.148 9, 實測值 352.149 3。

4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-苯基噻吩-2-甲酰胺 (4a)：白色固體，收率68.6 %. m.p. 182～183 ℃;1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ: 10.25 (s, 1H), 8.19 (d,J= 1.4 Hz, 1H),8.03 (s, 1H), 7.82 (d,J= 1.4 Hz, 1H), 7.77 (d,J= 0.9 Hz, 1H),7.75 - 7.73 (m, 2H), 7.37 (t,J= 7.9 Hz, 2H), 7.11 (t,J=7.4 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ:159.9, 140.3, 138.8, 136.3, 134.2, 128.8, 128.0, 127.7, 123.9,123.7, 120.4, 117.3, 38.8. HRMS(m/z, ESI-) 計算值C15H12N3OS [M-H]-282.070 7, 實測值 282.070 9。

4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-(4-(三氟甲氧基) 苯基) 噻吩-2-甲酰胺 (4b)：白色固體，收率71.6 %, m.p. 185～187 ℃;1H NMR (400 MHz, DMSO-d6),δ: 10.44 (s, 1H), 8.18 (d,J= 1.3 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.88 - 7.81 (m, 3H), 7.80 - 7.75(m, 1H), 7.38 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 3.88 (s, 3H);13C NMR (101 MHz,DMSO-d6),δ: 160.1, 144.03 (d,J= 2.0 Hz), 139.8, 138.1,136.3, 134.2, 128.0, 128.0, 124.1, 121.7, 121.7, 120.26 117.3,38.8. HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C16H11F3N3O2S [M-H]-366.366.052 7, 實測值 366.052 9。

4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-(間甲苯基) 噻吩-2-甲酰胺(4c)：白色固體，收率77.8 %, m.p. 195～196 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6),δ: 10.16 (s, 1H), 8.19 (d,J= 1.3 Hz,1H), 8.02 (s, 1H), 7.81 (d,J= 1.3 Hz, 1H), 7.76 (d,J= 0.6 Hz,1H), 7.56 (s, 1H), 7.53 (d,J= 8.3 Hz, 1H), 7.24 (t,J= 7.8 Hz,1H), 6.93 (d,J= 7.5 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 2.31 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ: 159.8, 140.3, 138.7, 138.0,136.3, 134.2, 128.7, 127.9, 127.7, 124.6, 123.7, 120.9, 117.5,117.4, 38.8, 21.3. HRMS(m/z, ESI-) 計算值 C16H14N3OS [MH]-296.086 0, 實測值296.086 1。

4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-(4-氯苯基) 噻吩-2-甲酰胺(4d)[22]：白色固體，收率84.5 %, m.p. 171～173 ℃(文獻(xiàn)值[22]：收率82.5 %. m.p. 172～173 ℃);1H NMR (400 MHz, DMSOd6),δ: 10.40 (s, 1H), 8.19 (d,J= 1.4 Hz, 1H), 8.06 (d,J= 0.7 Hz,1H), 7.87 (d,J= 1.3 Hz, 1H), 7.82 - 7.77 (m, 3H), 7.45 (d,J=8.9 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6),δ:160.1, 139.9, 137.9, 136.3, 134.3, 128.8, 128.1, 127.9, 127.6,124.0, 121.9, 117.4, 38.8. HRMS(m/z, ESI-) 計算值C15H11ClN3OS [M-H]-316.031 7, 實測值 316.031 9。

1.4 殺菌活性測定

1.4.1 殺菌活性初篩 采用菌絲生長速率法[23]測定。以噻呋酰胺為對照藥劑。稱取0.05 g (精確到0.000 1 g) 待測化合物，用2.50 mL 含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%吐溫-20 的DMF 溶液溶解，配制成20 000 mg/L的母液。各取母液0.20 mL，加入PDA 培養(yǎng)基中，制作含藥培養(yǎng)基，藥劑最終質(zhì)量濃度為50 mg/L。將直徑為6.00 mm 的供試病原菌塊轉(zhuǎn)移至含藥培養(yǎng)基中。每處理3 次重復(fù)。以僅用DMF 處理過的菌塊為空白對照，于 (23±2) ℃下培養(yǎng)4 d 后測量菌落直徑，計算其生長抑制率[22]。

1.4.2 殺菌活性復(fù)篩 采用菌絲生長速率法[23]測定。選擇水稻紋枯病菌、馬鈴薯早疫病菌、小麥赤霉病菌和草莓灰霉病菌為供試病原菌，對于初篩活性較好的化合物測定其EC50值?；衔锏馁|(zhì)量濃度梯度為50、25、12.5、3.125 和0.78 mg/L。

1.5 結(jié)合模式研究

通過分子對接研究配體和受體之間相互作用預(yù)測其結(jié)合模式。參考劉幸海等[24-25]的研究，在SDH 的活性口袋中對接活性較強的化合物3m。首先在蛋白數(shù)據(jù)庫 (Protein Data Bank) 中，找到并下載SDH 的結(jié)構(gòu) (PDB 代碼：2FBW)[26]，對受體蛋白進(jìn)行預(yù)處理，去除受體2FBW 的水分子和其他金屬原子，定義對接位點，然后繪制化合物3m 的分子結(jié)構(gòu) (Discovery Studio 2.5)，對其進(jìn)行能量最小化優(yōu)化，最后執(zhí)行對接程序[27]，詳細(xì)方法參考本課題組以往工作[22,28]。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物合成

參考文獻(xiàn)方法，以4-溴噻吩-2-甲酸甲酯為原料，在四 (三苯基膦) 鈀催化作用下與1-甲基-1H-吡唑-5-硼酸頻哪醇酯 (或1-甲基-1H-吡唑-4-硼酸頻哪醇酯) 反應(yīng)后得黃色固體；加入甲醇和氫氧化鈉溶液進(jìn)一步水解，反應(yīng)完成后立即加入鹽酸，調(diào)節(jié)pH 值至3～4，抽濾后得到中間體2-1(或2-2[22])。中間體2 溶于二氯甲烷 (DCM) 中與草酰氯反應(yīng)生成酰氯，低溫 (冰水浴) 下滴加各種胺類中間體和三乙胺的混合物，得到衍生物3[28]和4[21]。該合成路線操作簡單，反應(yīng)條件溫和。共合成了18 個目標(biāo)衍生物，其中17 個未見報道，其結(jié)構(gòu)均得到1H NMR、13C NMR 和HRMS 確證。

2.2 殺菌活性

初步離體殺菌活性測定結(jié)果 (表1) 表明，在50 mg/L 下，化合物3m 和4d 對水稻立枯絲核菌、化合物3k 和4d 對小麥赤霉病菌、化合物4d 對馬鈴薯早疫病菌、化合物3k、3m 和3n 對草莓灰霉病菌均具有優(yōu)異的抑制作用，抑制率均在80 %以上，尤其是化合物3m 對草莓灰霉病菌的殺菌活性高于對照藥劑噻呋酰胺。所有化合物對油菜菌核病和水稻惡苗病菌活性均較弱。

表1 目標(biāo)化合物對6 種植物病原菌的抑制作用Table 1 Inhibition of target compounds against six pathogenic fungi in vitro

續(xù)表1Table 1 (Continued)

根據(jù)初篩試驗結(jié)果，以商品化噻呋酰胺為對照藥劑，測定了部分化合物的EC50值。從表2 數(shù)據(jù)可以看出，化合物3m 和4d 對水稻立枯絲核菌具有一定的抑制活性，化合物3k 和4d 對小麥赤霉病菌的活性較強，化合物4d 對馬鈴薯早疫病菌的EC50值為15.7 mg/L，活性略高于噻呋酰胺，化合物3k 和3m 對草莓灰霉病菌的EC50值分別為15.3 和9.9 mg/L，活性與對照藥劑噻呋酰胺相當(dāng)。

表2 部分目標(biāo)化合物對4 種植物病原菌的EC50 值Table 2 EC50 value of some target compounds against four tested phytopathogens

從目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)來分析，化合物3d/4d、3h/4c 和3j/4a 是3 對吡唑環(huán)的位置異構(gòu)體，當(dāng)胺部分為取代苯胺和間甲基苯胺時，3h/4c，3j/4a 對6 種病原菌的活性差異都不大，說明吡唑環(huán)取代位置影響不大，但是當(dāng)胺部分為對氯苯氨基時，4-吡唑取代化合物4d 與5-取代吡唑化合物3d 相比，對6 種病原菌的活性明顯都偏高，說明4-吡唑位取代比5-吡唑位取代的位置異構(gòu)體活性要高，可能與對位氯原子的吸電子效應(yīng)有關(guān)。另外，在化合物3k、3m 和3n 結(jié)構(gòu)中，當(dāng)中間體的-NHR 與苯環(huán)間插入亞甲基或亞乙基時，-NHR 上氮原子的孤對電子無法與苯環(huán)共軛，從而使胺的堿性增強，由于苯乙胺的堿性強于芐胺，且均強于芳香胺，導(dǎo)致活性有所增強；對于化合物3m，在胺部分中苯乙氨基的對位引入氟原子時，由于氟原子具有吸電子效應(yīng)、模擬特性、滲透效應(yīng)和阻礙效應(yīng)等[29]，再加上對氟苯乙氨基具有較強的堿性，可能導(dǎo)致了化合物3m 對水稻立枯絲核菌和草莓灰霉病菌的殺菌活性明顯提高。其他苯環(huán)上的各種取代基與殺菌活性之間沒有明顯的規(guī)律性。根據(jù)我們先前的研究，吡唑聯(lián)苯[21]、吡唑聯(lián)吡咯[28]和吡唑聯(lián)呋喃甲酰胺類[28]等吡唑雜環(huán)甲酰胺類衍生物對病原真菌都表現(xiàn)出優(yōu)異的殺菌活性，而引入噻吩環(huán)時，可能由于硫原子電負(fù)性小于氮原子和氧原子，導(dǎo)致目標(biāo)衍生物對油菜菌核病菌的特異性下降，但對草莓灰霉病菌的活性明顯增強。

2.3 結(jié)合模式研究

通過分子對接，將活性較高的衍生物3m 和異丙噻菌胺 (配體) 分別對接到SDH (受體) 的活性位點，對接結(jié)果如圖1 所示，衍生物3m 分子結(jié)構(gòu)中的羧酸骨架插入到SDH 受體的疏水性口袋中，酰胺鍵上的羰基O 原子與受體B 鏈173 Trp上H 原子的距離為0.219 nm，形成了較強的氫鍵相互作用，這種氫鍵作用增強了配體和受體的結(jié)合力，從而提高了配體化合物的生物活性；異丙噻菌胺的噻吩五元環(huán)與D 鏈的TYR58 氨基酸殘基形成π-π 堆疊相互作用，較氫鍵相互作用弱，酰胺氧與氨基酸殘基H 距離0.466 nm。

3 結(jié)論

采用骨架躍遷優(yōu)化策略，將吡唑聯(lián)苯酰胺骨架中的苯環(huán)替換為異丙噻菌胺中的活性基團(tuán)噻吩，設(shè)計合成了18 個N-取代苯基-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺類衍生物，其中17 個為新化合物。離體殺菌活性試驗結(jié)果表明，部分目標(biāo)化合物對草莓灰霉病菌、小麥赤霉病菌和馬鈴薯早疫病菌顯示出較好的活性， 其中化合物3k 和4d 對小麥赤霉病菌的EC50值分別為18.5和14.3 mg/L，有一定的抑制活性，化合物4d 對馬鈴薯早疫病菌的EC50值為15.7 mg/L，活性略高于噻呋酰胺 (EC50值27.8 mg/L)；化合物3k 和3m 對草莓灰霉病菌的EC50值為15.3 和9.9 mg/L，與對照藥劑噻呋酰胺活性 (EC50值10.4 mg/L) 相當(dāng)。分子對接研究結(jié)果表明：具有較高活性的配體N-(4-氟苯基乙基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基) 噻吩-2-甲酰胺 (3m) 上的酰胺官能團(tuán)與受體琥珀酸脫氫酶 (SDH) 關(guān)鍵氨基酸殘基形成較強的氫鍵作用，從而增強了配體與受體間的結(jié)合力，提高了殺菌活性。因此通過骨架躍遷策略合成的含新穎吡唑噻吩羧酸骨架結(jié)構(gòu)的衍生物，尤其是3k、3m、4d 可作為SDHI 類殺菌先導(dǎo)化合物進(jìn)一步研究。