鄒會會 劉姍姍 梁玲 范曉軍 王繼兵

1德州市人民醫(yī)院眼科 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬德州市人民醫(yī)院 253014；2濰坊眼科醫(yī)院 濰坊醫(yī)學(xué)院碩士研究生培養(yǎng)基地 261041

青光眼濾過手術(shù)是治療青光眼常用的方法，術(shù)后人眼Tenon囊成纖維細胞(human Tenon capsule fibroblasts，HTFs)過度增生導(dǎo)致瘢痕化是青光眼濾過手術(shù)失敗的主要原因。目前臨床上常用的抗瘢痕抗代謝藥物有絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶[1-2]，臨床實踐證實這類藥物能抑制濾過通道組織的瘢痕化，提高青光眼手術(shù)的成功率，但藥物相關(guān)的毒性作用和不良反應(yīng)不容小覷。青光眼術(shù)后濾過通道瘢痕化一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題，探索不同機制的抑制瘢痕化藥物對于提高濾過手術(shù)的成功率具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷愈合過程中縫隙連接細胞間通訊(gap junctional intercellular communication，GJIC)功能下降，提示GJIC功能降低對創(chuàng)傷愈合具有重要的促進作用[3]。已有研究通過劃痕負荷法觀察到氯化鋰對體外培養(yǎng)的成纖維細胞具有上調(diào)GJIC的作用，同時發(fā)現(xiàn)其能夠促進大鼠肉芽組織的成熟，并且肉芽組織成纖維細胞GJIC的表達水平影響傷口愈合過程中肉芽組織沉積物的質(zhì)量和數(shù)量[4]。研究表明，體外培養(yǎng)的HTFs具有較強的GJIC功能，通過連接蛋白(connexin，Cx)43介導(dǎo)GJIC賦予細胞能夠相互傳遞信息的能力，提示在人眼創(chuàng)傷愈合過程中GJIC在成纖維細胞功能同步化方面發(fā)揮著重要作用[5]。本課題組先前的研究證實，作為GJIC上調(diào)劑的氯化鋰、芹黃素對體外培養(yǎng)的HTFs具有增生抑制作用，且氯化鋰在40～160 mmol/L范圍內(nèi)對HTFs的增生抑制作用呈時間和濃度依賴性[6-7]。本研究擬探討氯化鋰對HTFs的增生抑制作用是否與上調(diào)GJIC功能有關(guān)，以期為氯化鋰用于青光眼濾過手術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本來源 收集2019年4月于德州市人民醫(yī)院眼科行斜視手術(shù)的1例11歲女性斜視患者的Tenon囊組織。本研究經(jīng)德州市人民醫(yī)院倫理委員會批準(批文號：2019-023)，標本提供者知曉本研究目的并簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑及儀器 氯化鋰、熒光黃染料(Lucifer yellow dye，LY)、羅丹明-葡聚糖(Rhodamine-Dextran，RD)(美國Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國HyClone公司)；鼠抗人波形蛋白(vimentin)單克隆抗體(OTI5D7，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；FITC標記的兔抗鼠IgG二抗(ab6724，英國Abcam公司)；鼠抗人Cx43單克隆抗體(CX-1B1，美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。Forma CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；光學(xué)倒置顯微鏡(TH4-200，日本Olympus公司)；PCR儀、實時定量PCR儀(澳大利亞Corbett公司)；激光掃描共焦顯微鏡(德國Leica TCS SPE公司)。

1.2 方法

1.2.1HTFs培養(yǎng) 將斜視手術(shù)中所取的結(jié)膜下Tenon囊組織塊剪成1 mm×1 mm×1 mm的小組織塊，接種于培養(yǎng)皿中，周圍滴加1 ml含體積分數(shù)15%胎牛血清、100 U/ml(商品單位)青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，待組織塊貼壁牢固后，向培養(yǎng)皿中加入5 ml DMEM培養(yǎng)基，使組織塊浸入其中，進行傳代培養(yǎng)，取第4代細胞用于實驗。

1.2.2HTFs鑒定 將生長良好的第4代HTFs接種于6孔板中，生長達85%融合后，采用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次，質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定60 min，PBS洗3次，每次3 min，體積分數(shù)0.3% TritonX-100室溫孵育20 min，PBS洗3次，每次3 min，質(zhì)量分數(shù)10%正常山羊血清封閉液37 ℃孵育30 min，棄去封閉液，加入鼠抗人vimentin單克隆抗體(1∶ 200)4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3 min，加入稀釋的FITC標記兔抗鼠IgG二抗(1∶ 100)37 ℃孵育2 h，PBS洗3次，每次3 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。采用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3HTFs分組及處理 將細胞體透亮、細胞質(zhì)豐富的第4代細胞接種于6孔板，待細胞達60%～70%融合后，將6孔板培養(yǎng)的細胞分成對照組和氯化鋰處理組，對照組加入不含氯化鋰的細胞培養(yǎng)基，氯化鋰處理組加入含80 mmol/L氯化鋰的細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4細胞劃痕染料示蹤法評估GJIC功能 取6孔板培養(yǎng)的細胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞3次，加入相對分子質(zhì)量為457.24、質(zhì)量濃度為0.5 g/L的LY 1 ml和相對分子質(zhì)量為70 000、質(zhì)量濃度為0.5 g/L的RD染料1 ml，用手術(shù)刀片在平皿底部輕輕劃數(shù)條線，靜止5 min，吸出染液，PBS洗3次，去除游離的熒光染料及脫落的細胞。滴加4%多聚甲醛固定20 min后置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，記錄偶聯(lián)指數(shù)。RD只能局限于劃痕旁損傷的細胞中，不能通過GJIC傳遞，LY可以通過GJIC傳遞。偶聯(lián)指數(shù)=呈現(xiàn)黃綠色熒光的LY標記細胞數(shù)/呈現(xiàn)紅色熒光的RD標記細胞數(shù)，偶聯(lián)指數(shù)越高，與GJIC相關(guān)聯(lián)的成纖維細胞數(shù)量越多。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5細胞免疫熒光法檢測HTFs中Cx43的表達和定位 取6孔板培養(yǎng)的細胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞3次，每次3 min。4%多聚甲醛固定60 min，PBS洗3次，每次3 min。體積分數(shù)10%正常山羊血清封閉液37 ℃孵育30 min，棄去封閉液，加入稀釋的鼠抗人Cx43抗體(1∶ 250)4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3 min，加入稀釋的FITC標記的兔抗鼠IgG二抗(1∶ 100)37 ℃孵育2 h，PBS洗3次，每次3 min，Hoeschst33258染核20 min，PBS洗3次，每次3 min。采用體積分數(shù)50%無熒光緩沖甘油封片，在激光掃描共焦顯微鏡下觀察并拍照。Cx43主要分布于細胞相連處的細胞膜上，呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光。

1.2.6實時熒光定量PCR法檢測HTFs中Cx43 mRNA表達 取6孔板中的培養(yǎng)細胞，按照說明書提取總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Cx43正向引物序列為5’-ATAGACGGATCTGAGTGCCTGAA-3’，反向引物序列為5’-GCTCCAGTCACCCATGTTG-3’；GAPDH正向引物序列為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反向引物序列為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 s；95 ℃變性30 s，58 ℃退火及延伸20 s，循環(huán)40次。采用熔解曲線驗證擴增產(chǎn)物純度。以GAPDH為內(nèi)參照，各實驗組采用3管平行擴增，重復(fù)3次。采用2-△△Ct法計算Cx43 mRNA相對表達量。

1.2.7Western blot法檢測HTFs中Cx43蛋白表達 收集HTFs，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，樣品在95 ℃下變性5 min，每孔蛋白上樣量為30 μg，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上。質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉封閉1 h，加入鼠抗人Cx43單克隆抗體(1∶ 250)4 ℃過夜，PBS漂洗，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1∶ 2 500)室溫孵育1 min，X線曝光，以β-actin作為內(nèi)參，進行圖像掃描分析。Cx43蛋白相對表達量=Cx43蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗證實符合正態(tài)分布，以mean±SD描述，采用Levene檢驗證實組間數(shù)據(jù)資料方差齊，計數(shù)資料以頻數(shù)和百分數(shù)描述。采用均衡分組單因素干預(yù)兩水平研究設(shè)計，對照組與氯化鋰處理組間偶聯(lián)指數(shù)、Cx43 mRNA和蛋白相對表達量比較均采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HTFs鑒定

HTFs組織塊接種后約8 d可見細胞由組織塊周圍游離出來，細胞呈典型的長梭形，細胞體透亮，細胞質(zhì)豐富，細胞核呈圓形或橢圓形。3周左右長滿培養(yǎng)皿并融合，細胞呈單層放射狀或渦旋狀貼壁生長。培養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)中可見vimentin陽性表達，呈均勻的綠色熒光，細胞核為無熒光暗區(qū)(圖1)。根據(jù)取材部位、細胞形態(tài)及免疫熒光檢測可確定為HTFs。

圖1 培養(yǎng)細胞中vimentin免疫熒光染色圖(FITC ×400，標尺=40 μm) 培養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)中vimentin呈陽性表達，為綠色熒光Figure 1 Immunofluorescence staining of vimentin in cultured cells (FITC ×400,bar=40 μm) Vimentin-positive expression (green fluorescence) was observed in the cytoplasm

2.2 2個組HTFs偶聯(lián)指數(shù)比較

細胞劃痕染料示蹤實驗顯示，氯化鋰處理組LY傳遞的細胞層數(shù)明顯增多(圖2)。氯化鋰處理組細胞偶聯(lián)指數(shù)為9.04±0.53，明顯高于對照組的4.94±0.39，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-18.79，P<0.01)。

圖2 2個組HTFs細胞劃痕染料示蹤法測定(×100，標尺=160 μm) 帶有RD染料的細胞呈紅色熒光，帶有LY染料的細胞呈綠色熒光，RD僅局限于劃痕旁損傷的細胞中，LY通過GJIC向周圍細胞內(nèi)傳遞，氯化鋰處理組LY傳遞的細胞層數(shù)明顯增多 A：對照組RD熒光染色 B：氯化鋰處理組RD熒光染色 C：對照組LY熒光染色 D：氯化鋰處理組LY熒光染色Figure 2 Scrape-loading and dye transfer of HTFs in the two groups (×100,bar=160 μm) Cells with RD dye showed red fluorescence and cells with LY dye presented green fluorescence.RD was restricted to cells with parascratch damage,and LY could be delivered to the surrounding cells through GJIC.The number of cell layers stained with LY was significantly increased in the LiCl treatment group A:Control group with RD staining B:LiCl treatment group with RD staining C:Control group with LY staining D:LiCl treatment group with LY staining

2.3 2個組HTFs中Cx43的表達及定位比較

免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組HTFs中Cx43熒光呈點狀分布于細胞相連處的細胞膜上，呈綠色熒光，氯化鋰處理組HTFs中Cx43熒光強度較對照組明顯增強(圖3)。

圖3 2個組HTFs中Cx43免疫熒光染色圖(Hoeschst33258 ×400，標尺=40 μm) Cx43主要分布于細胞相連處的細胞膜上，呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光；與對照組相比，氯化鋰處理組Cx43染色明顯增強 A：對照組 B：氯化鋰處理組Figure 3 Immunofluorescence staining of Cx43 in HTFs of the two groups (Hoeschst33258 ×400,bar=40 μm) Cx43 expression (green fluorescence) was observed in the cell membrane between adjacent cells,and the nuclei showed blue fluorescence.Compared with the control group,Cx43 staining was obviously enhanced in the LiCl treatment group A:Control group B:LiCl treatment group

2.4 2個組HTFs中Cx43 mRNA表達比較

對照組Cx43 mRNA的相對表達量設(shè)為1，氯化鋰處理組Cx43 mRNA的相對表達量為1.97±0.23，明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-14.426，P<0.05)。

2.5 2個組HTFs中Cx43蛋白表達比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，氯化鋰處理組Cx43蛋白表達條帶亮度顯著強于對照組；氯化鋰處理組Cx43蛋白相對表達量為0.871±0.057，明顯高于對照組的0.446±0.028，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-11.682，P<0.01)(圖4)。

圖4 2個組Cx43蛋白表達比較 A：Western blot法檢測Cx43蛋白表達電泳圖 與對照組比較，氯化鋰處理組HTFs中Cx43蛋白表達條帶明顯增強 B：2個組Cx43蛋白相對表達量比較 與對照組比較，aP<0.05(獨立樣本t檢驗，n=3) Cx：連接蛋白；β-actin：β肌動蛋白Figure 4 Comparison of Cx43 protein expression between the two groups A:Electrophoretogram of Cx43 protein expression by Western blot Compared with the control group,the expression band of Cx43 protein in the LiCl treatment group was significantly enhanced B:Comparison of the relative expression levels of Cx43 protein between the two groups Compared with the control group,aP<0.05 (Independent-samples t test,n=3) Cx:connexin

3 討論

青光眼是以病理性眼壓升高造成特征性視神經(jīng)損害和視野缺損的一組疾病，若不及時進行有效治療會致盲。2020年全球原發(fā)性青光眼患病人數(shù)超過7 600萬，2040年將超過1億[8]。中國是青光眼患者人數(shù)較多的國家，2020年中國青光眼患者人數(shù)約為2 100萬，致盲人數(shù)達567萬[9-10]。對于藥物難以控制的青光眼，濾過性手術(shù)是首選的治療方法。為了提高手術(shù)成功率，術(shù)中常規(guī)應(yīng)用絲裂霉素、5-氟尿嘧啶等抗代謝藥物來抑制濾過通道的纖維瘢痕化，但術(shù)后濾過泡滲漏、皰疹感染、化膿性眼內(nèi)炎、慢性低眼壓、低眼壓性黃斑病變和角膜上皮細胞毒性等并發(fā)癥也隨之增多，使得其臨床應(yīng)用效果不佳[11]。因此，尋求新的瘢痕愈合調(diào)控方法成為眼科界面臨的挑戰(zhàn)。

縫隙連接是細胞與外界環(huán)境進行離子交換的膜通道結(jié)構(gòu)，對于維持細胞內(nèi)外離子動態(tài)平衡具有重要作用[12]。Cx43是哺乳動物體內(nèi)表達廣泛的Cx，某些信號分子與Cx43的羧基端特定位點相互作用可以調(diào)節(jié)縫隙連接通道的開放與關(guān)閉[13]?？p隙連接在創(chuàng)傷愈合的研究主要集中于皮膚，有研究證實，與正常成纖維細胞相比，增生性瘢痕中成纖維細胞間通訊受到抑制，瘢痕疙瘩中成纖維細胞間通訊被阻斷[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，正常成纖維細胞一旦相互接觸后則停止生長，而增生性瘢痕中的部分成纖維細胞和瘢痕疙瘩中成纖維細胞接觸后仍繼續(xù)增生[15-16]。這些研究表明，細胞間正常的通訊功能被抑制可能是導(dǎo)致瘢痕形成的原因之一。有研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后1～2 d，傷口邊緣細胞中Cx43的表達及細胞間的通訊連接功能短暫降低以促進細胞增生，隨著傷口的不斷愈合，Cx43的表達量逐漸升高，形成更多的GJIC，以便于細胞間的信息交流，而大量增生的細胞會逐漸凋亡[17]。降低傷口處Cx43蛋白的表達水平會顯著加快傷口愈合的速度和質(zhì)量，具體表現(xiàn)在角化細胞遷移和增生加快、纖維細胞分化為肌成纖維細胞的速度加快、肉芽組織形成及成熟提前等[18-21]。這些研究提示我們，在創(chuàng)傷愈合過程中，縫隙連接蛋白表達異常和GJIC功能異?？赡苁羌毎錾钴S導(dǎo)致瘢痕形成的原因之一。青光眼術(shù)后術(shù)區(qū)成纖維細胞過度增生導(dǎo)致瘢痕形成是手術(shù)失敗的主要原因，然而其瘢痕化和皮膚中瘢痕形成的原因是否一致，通過GJIC調(diào)節(jié)劑能否對青光眼濾過術(shù)區(qū)成纖維細胞進行有效干預(yù)仍不清楚，這是本課題研究的重點。

本實驗采用氯化鋰干預(yù)體外培養(yǎng)的HTFs 48 h，結(jié)果顯示HTFs間偶聯(lián)指數(shù)明顯高于對照組，證實氯化鋰具有上調(diào)GJIC功能的作用。氯化鋰處理組Cx43 mRNA和蛋白的相對表達量明顯高于對照組，對照組Cx43熒光呈點狀分布于細胞相連處的細胞膜上，氯化鋰處理組Cx43熒光染色明顯增強，證實氯化鋰能夠促進Cx43表達。由此推斷，氯化鋰增強GJIC功能是抑制HTFs增生的機制之一。這不僅為氯化鋰應(yīng)用于抗青光眼濾過手術(shù)瘢痕化提供了證據(jù)，也為調(diào)控青光眼濾過術(shù)后瘢痕化的治療提供了新的思路。然而，這一實驗是基于體外培養(yǎng)的HTFs完成，而氯化鋰在活體內(nèi)的抑制作用是否與體外一致，以及GJIC調(diào)節(jié)劑的確切療效和安全范圍等仍有待進一步在動物體內(nèi)驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明鄒會會：實驗研究的執(zhí)行人，完成數(shù)據(jù)整理與分析及論文寫作；劉姍姍：參與實驗研究和實驗結(jié)果分析；梁玲：協(xié)助完成細胞培養(yǎng)中的取材部分，參與指導(dǎo)實驗研究；范曉軍：參與數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析；王繼兵：本研究的設(shè)計者，制定整體的研究目標，指導(dǎo)并修改論文