胡惠貞，賈雪梅，桂 麗

(1.安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，安徽 池州 247000；2.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3.安徽醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230032)

頜下腺位于下頜體內(nèi)面的頜下腺凹內(nèi)，兼有內(nèi)外分泌功能，外分泌70%的唾液進入口腔，內(nèi)分泌生物活性肽經(jīng)血液循環(huán)調(diào)節(jié)多種組織和細(xì)胞的生理活動，目前發(fā)現(xiàn)其分泌的活性肽已有30多種。糖尿病是以血葡萄糖水平升高為特征的代謝疾病群，近年來，其發(fā)病率逐漸升高，成為全球患病率較高的一種慢性疾病，嚴(yán)重威脅了人們的健康，影響了人們的生活質(zhì)量[1]。頜下腺具有特殊的生物學(xué)功能，其在糖尿病發(fā)病時的病理變化越來越受到人們的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠頜下腺光鏡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了紊亂[2]，但隨著病程的發(fā)展，糖尿病大鼠頜下腺的電鏡結(jié)構(gòu)有什么變化？作為治療糖尿病的經(jīng)典藥物，胰島素對糖尿病頜下腺電鏡結(jié)構(gòu)又有哪些影響？目前尚未可知，本實驗通過復(fù)制糖尿病大鼠模型并給予胰島素治療，觀察各組大鼠頜下腺的電鏡結(jié)構(gòu)，為探索胰島素治療糖尿病并發(fā)癥的可能機制提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量150～180 g，安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，普通級。大鼠自由攝食，飼養(yǎng)室室溫(22±2)℃，濕度50%，晝夜交替12 h。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備鏈脲佐菌素(美國Sigma公司生產(chǎn))。LKB-NOVA型超薄切片機(瑞士DAKO公司)，JEM-1230型透射電鏡(日本JEOL公司)。

1.3 方法48只雄性SD大鼠，隨機選擇16只為對照組，給予一般飼料喂養(yǎng)，自由攝取食水；32只給予高脂飼料喂養(yǎng)2個月，待其產(chǎn)生胰島素抵抗(連續(xù)2次餐后血糖>11.1 mmol/L)后，腹腔注射2% 鏈脲佐菌素(25 mg/kg)一次，7 d后抽血檢測空腹血糖>7.0 mmol/L，提示Ⅱ型糖尿病大鼠模型造模成功。造模成功的大鼠再隨機分為治療組及糖尿病組，每組各16只。治療組每天上午9點給予皮下注射胰島素(4 iu/kg)，糖尿病組不給予任何處理。三組大鼠均予一般飼料喂養(yǎng)，不限食水。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 FBG水平檢測 在造模成功給予相應(yīng)處置后3個月和6個月，每組各隨機抽取8只大鼠，禁食12 h，用20%烏拉坦1 mL/100 g予以腹腔注射，麻醉后剖開腹腔，迅速從腹腔靜脈抽血5 mL送檢FBG，并取出各組大鼠下頜下腺組織。

1.4.2 頜下腺組織觀察 將頜下腺組織用雙面刀片修成1 mm3小塊并用2.5%戊二醛溶液固定，環(huán)氧樹脂包埋后進行切片(70 nm)，將切片置入飽和醋酸鈾水溶液中染色30 min，水洗后經(jīng)檸檬酸鉛染液15 min，JEM-1230透射電鏡觀察并攝片。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析運用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件，計量數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；各組大鼠FBG濃度進行單因素方差分析，組間差異采用q檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組FBG結(jié)果(1)組內(nèi)比較：對照組大鼠在3個月和6個月FBG保持穩(wěn)定，兩個時間點無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；糖尿病組大鼠隨病程的延長FBG顯著升高，在造模后3個月和造模后6個月兩個時間點差異具有顯著性(P<0.05)；治療組大鼠隨著病程的延長升高，在造模后3個月和造模后6個月兩個時間點差異也具有顯著性(P<0.05)。(2)組間比較：造模后3個月，糖尿病組顯著高于對照組，治療組較糖尿病組顯著降低，但較對照組升高，三組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；造模后6個月，糖尿病組顯著高于對照組，治療組較糖尿病組顯著降低，但較對照組升高，三組間比較均有差異(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠FBG濃度比較(mmol/L)

2.2 電鏡觀察

2.2.1 顆粒曲管上皮細(xì)胞 造模后3個月：對照組上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)飽滿清晰，嵴完整(圖1-A)；糖尿病組結(jié)構(gòu)不清，線粒體內(nèi)有少量空泡，嵴斷裂(圖1-B)；治療組線粒體結(jié)構(gòu)清楚(圖1-C)。造模后6個月：與對照組(圖1-D)及造模后3個月糖尿病組比較(圖1-B)，糖尿病組線粒體膜不完整，結(jié)構(gòu)不清，空泡增多(圖1-E)，治療組線粒體結(jié)構(gòu)清晰，嵴稍松散(圖1-F)。

圖1 大鼠頜下腺顆粒曲管上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體(×10000)

2.2.2 頜下腺腺細(xì)胞 造模后3個月：對照組腺細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈扁平囊狀，板層狀排列，結(jié)構(gòu)緊密，內(nèi)腔均勻(圖2-A)；糖尿病組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)稍松散，內(nèi)腔輕度擴大(圖2-B)；治療組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常(圖2-C)。造模后6個月：糖尿病組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張呈囊泡狀，結(jié)構(gòu)疏松(圖2-E)，治療組可見少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈管狀擴張(圖2-F)。

圖2 大鼠頜下腺腺細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(×10000)

3 討論

糖尿病主要是因胰島素抵抗或胰島素分泌不足導(dǎo)致的一組以高血糖為特征的代謝性疾病，久病可引起多器官的損傷。研究表明，體脂含量升高和體脂分布失常易導(dǎo)致機體對胰島素不敏感，誘發(fā)加重胰島B細(xì)胞功能損害，引起糖代謝紊亂，本實驗通過喂養(yǎng)高脂飲食引起大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗后注射鏈脲佐菌素，成功復(fù)制了糖尿病動物模型。本實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠頜下腺導(dǎo)管細(xì)胞出現(xiàn)線粒體嵴斷裂并呈空泡樣改變，腺細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈囊泡狀擴張，且這些改變隨著病程的延長加劇。引起糖尿病大鼠頜下腺出現(xiàn)上述結(jié)構(gòu)變化的因素可能有：(1)高血糖引起大量自由基生成，致使機體發(fā)生氧化應(yīng)激直接引起組織結(jié)構(gòu)損傷；(2)葡萄糖多元醇通路的激活，使其轉(zhuǎn)化為山梨醇，后者親水性強，會導(dǎo)致細(xì)胞水腫變性，結(jié)構(gòu)損傷；(3)糖尿病大鼠頜下腺內(nèi)nNOS表達(dá)升高和NT-3表達(dá)降低，致使頜下腺內(nèi)氧化反應(yīng)加劇及其支配神經(jīng)營養(yǎng)缺乏，從而引起結(jié)構(gòu)紊亂[3]。線粒體是細(xì)胞進行有氧呼吸的主要結(jié)構(gòu)，線粒體內(nèi)膜向基質(zhì)折疊形成線粒體嵴，其上有含線粒體合酶的線粒體基粒，能合成三磷酸腺苷為細(xì)胞的新陳代謝提供能量，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由多層扁平膜囊狀的核糖體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共同構(gòu)成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)大分子的合成場所。糖尿病引起頜下腺內(nèi)線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的病變，會直接影響頜下腺功能及其內(nèi)生物大分子的合成，可能是導(dǎo)致糖尿病患者唾液流率下降[4]、并引起其內(nèi)水通道蛋白1、5和8[5-6]、血管內(nèi)皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β1[7]等表達(dá)異常的原因之一。而鑒于頜下腺不僅能外分泌唾液經(jīng)導(dǎo)管進入消化道參與消化生理過程，還能分泌多種生物活性物質(zhì)參與調(diào)節(jié)機體的功能活動，所以其內(nèi)生物活性物質(zhì)的改變還有可能引起胃腸及其靶器官功能的改變，但它們之間具體的關(guān)聯(lián)性還有待進一步研究。

研究表明Ⅱ型糖尿病患者的胰島B細(xì)胞水平低于正常健康個體，致使胰島素分泌不足[8]，而胰島素作為體內(nèi)唯一降血糖的激素，可通過提高葡萄糖的利用和脂肪的合成，抑制糖原及脂肪的分解氧化等途徑來降低血糖，另外其自身還具有免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)營養(yǎng)的功能，因此及時給予合理、規(guī)范的胰島素治療對控制Ⅱ型糖尿病患者的血糖血脂及胰島B細(xì)胞功能的損害極為關(guān)鍵[9-10]，李紅等研究發(fā)現(xiàn)對于初發(fā)Ⅱ型糖尿病患者使用胰島素治療，能有效控制血糖，減輕胰島素抵抗，改善胰島B細(xì)胞功能，并通過改變患者的脂質(zhì)代謝紊亂，減輕炎性反應(yīng)[11-12]。本實驗在糖尿病造模成功即給予大鼠胰島素治療，使治療組大鼠血糖水平較糖尿病組顯著降低，并通過降低頜下腺內(nèi)nNOS表達(dá)及增加NT-3表達(dá)[3]有效地控制了高血糖對頜下腺結(jié)構(gòu)造成的損傷，僅在造模6個月時出現(xiàn)輕微改變，鑒于頜下腺的內(nèi)外分泌腺功能，這也可能是胰島素控制糖尿病并發(fā)癥的原因之一。同時，我們也必須要注意到給予糖尿病患者外援性的胰島素治療，雖可很好的控制血糖，但其不能及時和體內(nèi)血糖水平同步調(diào)節(jié)，在運動、飲食等因素的影響下，會造成患者體內(nèi)即時血糖水平發(fā)生波動，甚至?xí)霈F(xiàn)低血糖。吳方團[13]等研究也提示老年Ⅱ型糖尿病患者的血糖控制水平既要考慮高血糖對靶器官的損害，也要避免發(fā)生低血糖，因此胰島素治療期間大鼠是否有血糖波動甚至低血糖的情況發(fā)生，以及如何降低低血糖發(fā)生風(fēng)險將是我們下一步研究的方向。