李璐燕，陳夢湘，何國獻，余敏，吳越，向惠英，邵世和

(1.江蘇大學醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212000；2.常州市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇常州213000)

癌癥作為一種由多種因素引起的疾病，具有較高的發(fā)病率和死亡率。癌癥的早期診斷是改善腫瘤患者預后的有效途徑之一[1]，尋找新的腫瘤標志物對癌癥的早期診斷具有重要意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度超過200 bp的非編碼RNA，其作為一種新的生物學標志物，對癌癥的診斷、治療和預后具有一定的臨床價值[2]。多種LncRNA已被證實與癌癥相關，例如，Chen等[3]發(fā)現(xiàn)沉默Lnc00958可以預防胰腺癌的進展。Wu等[4]證實，lncHDAC2能促進肝癌干細胞的擴散和自我更新。Xiao等[5]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-TTTY15在前列腺癌組織中過表達，促進了前列腺癌的進展。ZFAS1最初被證實在乳腺上皮分化和肺泡發(fā)展過程中發(fā)揮調控作用[6]。后續(xù)大量研究發(fā)現(xiàn)，該LncRNA在胃癌、食道癌、神經膠質瘤、結直腸癌、非小細胞肺癌和其他癌癥患者中均呈異常表達[7-11]，且ZFAS1基因高表達患者的總生存率、無病生存率均較差[12-13]。然而，由于研究癌癥類型單一，樣本量小，結果不具有代表性。因此，本研究旨在通過薈萃(meta)分析確定ZFAS1與癌癥患者臨床預后的關系，并進一步驗證ZFAS1作為腫瘤標志物的潛在價值。

1 材料和方法

1.1文獻檢索策略 利用電子數(shù)據(jù)庫PubMed、Cochrane Library、Web of Science、Wiley Online Library等，使用以下關鍵詞：“ZFAS1”、“LncRNAZFAS1”或“l(fā)ong non-coding RNAZFAS1”、“cancer”和“tumor”進行檢索。檢索日期截至2020年7月10日。

1.2納入和排除標準 納入研究需滿足以下條件：(1)與ZFAS1關聯(lián)的癌癥研究；(2)將患者分為基因高、低水平表達組，分類標準為腫瘤組織中ZFAS1基因的表達水平；(3)提供相關的臨床資料；(4)提供生存分析相關的風險比率(hazard ratio，HR)和95%置信區(qū)間(95% confidence interval，CI)或可以獲取生存曲線。排除標準：(1)綜述、meta分析、病例報告和重復出版物；(2)臨床資料不足的研究。

1.3數(shù)據(jù)提取和質量評估 提取數(shù)據(jù)包括：文章出版信息(包括作者名稱、出版時間、癌癥類型)、基因檢測方法，ZFAS1基因高、低表達組患者數(shù)量，臨床病理參數(shù)(包括TNM分期、是否發(fā)生淋巴結轉移、遠處轉移、性別)以及生存相關(包括生存率和無病生存率)的HR值及95%CI、P值。研究質量評估包括：(1)納入患者的選擇；(2)組間的可比性；(3)隨訪結果。

1.4統(tǒng)計學分析 采用危險比(HR值)及95%CI評估ZFAS1與癌癥患者臨床預后之間的關系。在本次研究所納入的文章中，部分HR值可以直接從原文中獲取，部分研究并未提供，對于無法直接獲得HR值的研究則需通過原文中的生存曲線獲得原始數(shù)據(jù)，并使用Engauge Digitizer 4.2版軟件(http://digitizer.sourceforge.net/)計算HR值和95%CI。異質性分析采用卡方Q檢驗和HigginsI2統(tǒng)計量分析?；诤喜⑿康漠愘|性，選擇固定效應模型或隨機效應模型。當異質性明顯(I2>50%或P<0.05)時，采用隨機效應模型，反之則采用固定效應模型。在臨床病理因素方面，將患者按照性別分為男性和女性，根據(jù)是否診斷為淋巴結轉移、遠處轉移分為陽性和陰性，根據(jù)TNM分期分為早期(Ⅰ+Ⅱ期)組和晚期(Ⅲ+Ⅳ期)。

2 結果

2.1研究選擇及特點 根據(jù)文獻篩選策略，共篩出152項研究。閱讀標題和摘要后，有72篇文章因是動物研究、綜述、meta分析或無關研究被刪除。通篇閱讀文章后，因缺乏生存結果或臨床病理參數(shù)的必要信息，有5篇文章被排除。最終選擇21篇文章進行meta分析，共17種癌癥，其中包括肝癌2篇[13-14]，結直腸癌4篇[15-18]，大腸癌1篇[19]，胃癌1篇[20]，骨肉瘤1篇[21]，卵巢癌1篇[12]，非小細胞肺癌1篇[11]，膠質瘤1篇[22]，膀胱癌1篇[23]，黑色素瘤1篇[24]，前列腺癌1篇[25]，腎透明細胞癌1篇[26]，膽管癌1篇[27]，食管鱗狀細胞癌1篇[28]，鼻咽癌1篇[29]，宮頸癌1篇[30]，子宮內膜癌1篇[31]。所有患者均基于明確的病理診斷。本次研究共包含1 765例患者，且納入的研究均將患者分為高表達組和低表達組，分類標準為癌癥組織中ZFAS1表達情況，檢測方法均為qRT-PCR。21項研究均來自中國。見表1。

表1 本次meta分析納入研究的臨床特征

2.2ZFAS1表達與癌癥患者總生存率OS及無病生存率DFS的相關性 采用HR值及95%CI分析ZFAS1表達與患者生存率的關系。其中16項研究分析了總生存率OS與ZFAS1表達水平之間的關聯(lián)，4項研究分析了無病生存率DFS與ZFAS1表達水平的關聯(lián)。結果顯示，總生存率HR合并結果為1.85(95%CI：1.67～2.05，Z=11.78，P<0.000 01)，見圖1A。無病生存率HR合并結果為1.92(95%CI：1.51～2.44，Z=5.35，P<0.000 01)，見圖1B。由于研究間不存在明顯異質性，分析方法均采用固定效應模型。此外，根據(jù)腫瘤類型進行亞組分析，將納入的研究按照腫瘤種類分為消化系統(tǒng)腫瘤組(包括胃癌、肝癌、結直腸癌、膽管癌、大腸癌、食管鱗狀細胞癌)，呼吸系統(tǒng)腫瘤組(包括非小細胞肺癌、鼻咽癌)，泌尿生殖道系統(tǒng)腫瘤組(包括膀胱癌、子宮內膜癌、宮頸癌、腎透明細胞癌、前列腺癌、卵巢癌)及其他系統(tǒng)腫瘤組(包括膠質瘤、骨肉瘤、黑色素瘤)。結果顯示，ZFAS1高表達能夠顯著降低消化系統(tǒng)腫瘤(HR=1.78，95%CI：1.52～2.08，Z=7.18，P<0.000 01)，泌尿生殖道系統(tǒng)腫瘤(HR=2.03，95%CI：1.54～2.68，Z=4.99，P<0.000 01)，呼吸系統(tǒng)腫瘤(HR=1.64，95%CI：1.30～2.07，Z=4.16，P<0.0001)及其他腫瘤(HR=1.87，95%CI：1.68～2.07，Z=7.10，P<0.000 01)患者的生存率，見圖1C。

注：A，ZFAS1表達與癌癥患者總生存期OS相關性的森林圖；B，ZFAS1表達與癌癥患者無病生存期DFS相關性的森林圖；C，ZFAS1表達與癌癥患者總生存期OS相關性按癌癥類型亞組分析森林圖；degestive system,消化系統(tǒng)；respiratory system,呼吸系統(tǒng)；urogenital system,泌尿生殖系統(tǒng)；other system,其他系統(tǒng)。

2.3ZFAS1表達與癌癥患者臨床病理參數(shù)的相關性 采用OR值及95%CI評估ZFAS1表達與患者臨床病理參數(shù)的關系。其中15項研究共納入1 416例患者的臨床TNM分期數(shù)據(jù)，13項研究納入1 070例患者的淋巴結轉移情況，8項研究納入629例患者的癌癥遠處轉移情況，16項研究納入1 447例患者的性別，具體統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2。分析結果顯示，ZFAS1基因高表達的患者與TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期(OR=2.87，95%CI：2.31～3.57，Z=9.55，P<0.000 01)，更易發(fā)生淋巴結轉移(OR=2.44，95%CI：1.40～4.25，Z=3.13，P=0.002)和腫瘤的遠處轉移(OR=1.90，95%CI：0.86～4.18，Z=1.59，P=0.000 9)有關。而患者性別與ZFAS1的表達并無明顯關聯(lián)(OR=1.06，95%CI：0.86～1.31，Z=0.57，P=0.23)。見圖2。

注：A，TNM分期；B，遠處轉移；C，淋巴結轉移及侵襲；D，性別。

2.4web GEPIA數(shù)據(jù)庫驗證結果 使用基因表達譜動態(tài)分析數(shù)據(jù)庫web GEPIA分析ZFAS1在癌組織與癌旁組織中的表達水平，并通過對TCGA和GTEx項目RNA測序表達數(shù)據(jù)進行分析，結果表明，與相應的癌旁組織相比，ZFAS1在多種癌組織中均明顯升高。見圖3。

注：CHOL，膽管癌；COAD，結腸癌；DLBC，彌漫性大b細胞淋巴瘤；GBM，多形性成膠質細胞瘤；KIRC，腎透明細胞癌；LGG，腦低級別膠質瘤；LIHC，肝臟肝細胞癌；nam(T),癌組織;num(N),癌旁組織。

2.5敏感性分析與發(fā)表偏倚 應用Stata 12.0軟件檢測刪除數(shù)據(jù)對總生存率合并結果的影響，并驗證結果的穩(wěn)健性，漏斗圖結果顯示不存在明顯發(fā)表偏倚。見圖4A、4B。

注：A，敏感性分析結果；B，漏斗圖。

3 討論

LncRNAs曾經被認為是基因垃圾，但越來越多的研究表明，它在腫瘤細胞的生命活動中發(fā)揮重要作用，包括轉錄調控、基因剪接、翻譯和細胞成分的組裝等[32]。多種LncRNAs已經被貼上致癌基因或腫瘤抑制基因的標簽[33-34]，對腫瘤診斷具有重要價值。近年來，LncRNAsZFAS1被證實在多種腫瘤組織中異常表達。查閱文獻可知，其在結直腸癌、胃癌、肝癌、膽囊癌等消化系統(tǒng)腫瘤中的研究較為深入廣泛，但在其他類型癌癥中研究相對較少。本次meta分析基于以上研究基礎，綜合分析ZFAS1表達在各系統(tǒng)腫瘤預后診斷價值，亞組分析結果顯示，高表達的ZFAS1與消化系統(tǒng)、泌尿生殖道系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等腫瘤的低生存率均具有顯著相關性。此外，為重點研究ZFAS1表達水平與癌癥患者臨床病理參數(shù)之間的潛在聯(lián)系，筆者收集了患者性別、TNM分期、淋巴結轉移和遠處轉移等數(shù)據(jù)進行分析。結果表明，與低表達組相比，ZFAS1高表達患者TNM分期更易發(fā)展為Ⅲ/Ⅳ期，且更易發(fā)生淋巴結轉移及遠處轉移。綜上所述，高表達的ZFAS1與腫瘤患者的不良預后具有明顯相關性。

為進一步探究ZFAS1在癌癥中發(fā)揮調控作用的分子機制，筆者發(fā)現(xiàn)目前針對該LncRNA的研究主要集中于競爭性內源性RNA(Competitive endogenous RNA, ceRNA)調控機制。ceRNA假說最早由Leonardo Salmena等提出，該假說論證了細胞中編碼和非編碼RNA是如何相互作用并進一步影響細胞表型[35]。MicroRNA是具有代表性的非編碼RNA，其主要在分子水平上發(fā)揮重要作用，研究證實LncRNAZFAS1與多種miRNAs之間存在調控環(huán)路。通過查閱文獻，筆者發(fā)現(xiàn)能夠與ZFAS1直接結合的MicroRNA主要有miR-150-5p[12,15,24,36-37]、miR-590-3p[38-40]、miR-1271-5p[41-42]、miR-193a-3p[43-44]、miR-421[45]，其中miR-150-5p、miR-590-3p被證實在多種癌癥中均能夠被ZFAS1特異性吸附。此外，ZFAS1調控的靶基因具有多樣性，可以從細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及細胞耐藥性等方面調控癌癥進展。

本研究仍存在一定的局限性：(1)納入文章數(shù)量和樣本量有限；(2)所有納入的研究均在中國進行，可能存在種族及地域差異；(3)本次meta分析僅包括英文出版物；(4)部分HR值無法從原文獲取，而是由生存曲線計算獲得。本研究還需在今后的臨床研究中驗證。

綜上所述，本次meta分析證實ZFAS1是一種重要的腫瘤標志物，高表達的ZFAS1預示著癌癥患者較差的生存期和不良的臨床預后。ZFAS1作為ceRNA直接或間接與MicroRNA結合，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。