馮偉，宗煒，鞠少卿

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，江蘇南通 226001)

胃癌(gastric cancer, GC)是起源于胃粘膜上皮的惡性腫瘤，死亡率位于全球惡性腫瘤的第三位[1]。GC的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多階段、多因素的病理過程[2]。臨床診斷主要依靠影像學(xué)檢查、病理活檢以及血清標(biāo)志物檢測，但早期胃癌診斷的陽性率較低，易造成漏診、誤診。近年來研究表明，包括GC在內(nèi)的許多腫瘤組織中存在大量的非編碼RNA，其中關(guān)于LncRNA、miRNA和mRNA研究最為豐富[3]。ceRNA假說最早是由Salmena等[4]提出，其認(rèn)為任何含有miRNA反應(yīng)元件(miRNA response elements，MREs)的基因都可以通過MRES與miRNA結(jié)合，從而影響其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。LncRNAs廣泛分布于真核細(xì)胞中，具有多種MREs，能夠競爭性結(jié)合miRNAs。因此，深入挖掘胃癌中“LncRNA-miRNA-mRNA”的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為胃癌診治提供新的依據(jù)和靶點(diǎn)，具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值和廣泛的前景。

本研究擬聯(lián)合TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因篩選，挖掘胃癌中差異表達(dá)的LncRNAs、miRNAs以及mRNAs，構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的差異mRNAs進(jìn)行GO分析以及KEGG分析，探究差異基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的潛在調(diào)節(jié)機(jī)制；利用熒光定量PCR對(duì)部分差異基因進(jìn)行臨床標(biāo)本驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載 利用TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載人類胃癌的RNA-Seq和miRNA-Seq的Count數(shù)據(jù)，其中包含343例胃癌組織樣本和30例胃正常組織樣本；利用GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nih.gov/geo/)下載GSE93415數(shù)據(jù)集的miRNA芯片數(shù)據(jù)，其中包含20對(duì)胃癌組織樣本和癌旁組織樣本。

1.2差異基因篩選 利用edgeR函數(shù)包對(duì)TCGA數(shù)據(jù)整理分析，篩選并確定差異表達(dá)的LncRNAs、mRNAs和miRNAs；利用limma函數(shù)包對(duì)GEO數(shù)據(jù)整理分析，篩選并確定差異表達(dá)的miRNAs。差異基因篩選條件：(1)對(duì)LncRNAs和mRNAs差異表達(dá)倍數(shù)取對(duì)數(shù)：|logFC|>2，P<0.05；(2)對(duì)miRNAs差異表達(dá)倍數(shù)取對(duì)數(shù)：|logFC|>1，P<0.05。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)用于校正所有P值的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；鑒于GEO數(shù)據(jù)庫胃癌組織樣本量偏少，|logFC|>2，P<0.05的DEmiRNAs數(shù)量較少，篩選|logFC|>1，P<0.05的DEmiRNAs進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于ceRNA理論，利用miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測與miRNAs存在調(diào)控關(guān)系的LncRNAs；利用starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測與miRNAs存在調(diào)控關(guān)系的mRNAs；將預(yù)測結(jié)果分別與數(shù)據(jù)庫篩選出的差異表達(dá)的LncRNAs和mRNAs取交集，將TCGA數(shù)據(jù)庫與GEO數(shù)據(jù)庫中差異表達(dá)的miRNAs取交集；利用Cytoscape軟件將差異表達(dá)的LncRNAs、miRNAs和mRNAs三者的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.4富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)25個(gè)mRNAs進(jìn)行功能富集分析和通路富集分析，根據(jù)篩選條件(P<0.05)對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行匯總，結(jié)果以氣泡圖呈現(xiàn)。

1.5表達(dá)量驗(yàn)證 利用血清RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)公司)提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)和特異引物合成互補(bǔ)DNA(cDNA)。采用LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量儀(Roche公司)檢測DELncRNAs的相對(duì)表達(dá)量，LncRNAs引物序列見表1。選擇18S內(nèi)參對(duì)LncRNAs的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 LncRNAs引物序列

2 結(jié)果

2.1差異基因篩選 根據(jù)設(shè)定的篩選條件，分別從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得高表達(dá)的LncRNAs 895個(gè)，低表達(dá)的LncRNAs 207個(gè)，高表達(dá)的mRNAs 937個(gè)，低表達(dá)的mRNAs 740個(gè), 高表達(dá)的miRNAs 180個(gè)，低表達(dá)的miRNAs 60個(gè)；從GEO數(shù)據(jù)庫中獲得高表達(dá)的miRNAs 49個(gè)，低表達(dá)的miRNAs 23個(gè)。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)篩選的差異miRNAs取交集，得到18個(gè)共同的miRNAs，其中上調(diào)的miRNAs 12個(gè)，下調(diào)的miRNAs 6個(gè)。

2.2ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將miRcode數(shù)據(jù)庫、TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫三者聯(lián)合篩選差異LncRNAs，得到52個(gè)LncRNAs。利用starBase數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫篩選差異mRNAs，得到25個(gè)mRNAs。最終，將52個(gè)LncRNAs、18個(gè)miRNAs以及25個(gè)mRNAs進(jìn)行ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建(圖1)，ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見表2。

注：菱形、圓形和矩形分別表示LncRNAs、mRNAs和miRNAs；紅色表示高表達(dá)，藍(lán)色表示低表達(dá)。

表2 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.3基因功能和通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在6個(gè)生物學(xué)過程，包括受體配體激活、信號(hào)受體激活、絲氨酸型肽酶激活、絲氨酸水解酶激活、化學(xué)排斥物激活以及跨膜受體蛋白絡(luò)氨酸激酶激活等(P<0.05，圖2A)；KEEG通路分析結(jié)果涉及癌癥中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)失調(diào)、癌癥中的miRNAs(P<0.05，圖2B)。

注：A，DEmRNAs的GO分析氣泡圖；B，DEmRNAs的KEGG分析氣泡圖。

2.4血清驗(yàn)證差異LncRNAs 利用熒光定量PCR檢測胃癌患者血清中差異LncRNAs的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，Linc00052、Linc00365和Linc00330在胃癌患者和健康人血清樣本中存在明顯差異(P<0.05)，但Linc00184在胃癌患者和健康人血清樣本中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 胃癌患者血清中DELncRNAs的表達(dá)水平

3 討論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因參與的、多水平調(diào)控的復(fù)雜過程。絕大多數(shù)胃癌患者早期無明顯癥狀，易與胃炎、胃潰瘍等胃良性疾病混淆。胃癌診斷主要依靠影像學(xué)檢查以及實(shí)驗(yàn)室檢測，但傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查不能滿足臨床需求[5]。近年來，國內(nèi)外研究表明，異常表達(dá)的ncRNAs不僅可以作為疾病的早期篩查指標(biāo)，還能作為患者預(yù)后監(jiān)測及治療的靶點(diǎn)，為癌癥患者帶來了新的希望[6-7]。

本研究通過對(duì)現(xiàn)有胃癌樣本基因表達(dá)譜進(jìn)行篩選，結(jié)合樣本的臨床病理數(shù)據(jù)，分析各基因差異表達(dá)水平以及患者生存預(yù)后，根據(jù)“高表達(dá)LncRNA-低表達(dá)miRNA-高表達(dá)mRNA”和“低表達(dá)LncRNA-高表達(dá)miRNA-低表達(dá)mRNA”這兩種調(diào)控軸構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)，筆者篩選出潛在的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)現(xiàn)部分ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已有相關(guān)研究發(fā)表。Teng 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA NKX2-1-AS1能夠競爭性結(jié)合miR-145-5p，從而促進(jìn)SERPINE1的表達(dá)，激活VEGFR-2信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌的惡性進(jìn)展。Piao等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Linc00184同樣能夠競爭性結(jié)合miR-145，促進(jìn)ANGPT2表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。Yan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Linc00365在胃癌中的表達(dá)降低，而低表達(dá)的Linc00365能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖，其進(jìn)一步通過機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Linc00365能夠抑制NF-κB信號(hào)通路，從而抑制胃癌的惡性進(jìn)展。以上研究均表明，生物信息學(xué)預(yù)測能夠?qū)Π┌Y的基礎(chǔ)研究有所啟發(fā)，同時(shí)還能為癌癥新的診治靶點(diǎn)和思路提供理論支撐，使得后續(xù)的基礎(chǔ)驗(yàn)證和臨床研究更具有針對(duì)性，能夠避免盲目的實(shí)驗(yàn)探究并減少科研資源的浪費(fèi)。

雖然生物信息學(xué)對(duì)科學(xué)研究有很大的幫助，但其仍有一定的局限性，例如，芯片分析結(jié)果的質(zhì)量存在一定差異，以及易與實(shí)際實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證存在一定誤差等。因此，生物信息學(xué)分析的結(jié)果最終需要大量的臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。筆者針對(duì)部分差異表達(dá)的LncRNAs設(shè)計(jì)了特異的引物(表2)，并利用熒光定量PCR在胃癌患者血清樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，Linc00052、Linc00330、Linc00365在胃癌患者血清樣本中的表達(dá)水平與芯片結(jié)果一致，但Linc00184的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且表達(dá)水平與芯片結(jié)果并不一致，可能由于樣本量較少的原因，也可能由于芯片結(jié)果主要來源于胃癌組織，其表達(dá)水平可能與血清樣本存在一定的差異。后期，我們將針對(duì)構(gòu)建的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，特別是針對(duì)目前在胃癌中暫無相關(guān)研究的Linc00330，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和樣本類型，收集胃良性病變的血清和組織樣本，同時(shí)在不同胃癌細(xì)胞系進(jìn)行體內(nèi)外功能驗(yàn)證，或許能夠?yàn)槲赴┑脑\斷和治療提供新的依據(jù)。