劉雙，林征，俞凱莉，陳輝林，饒雯清，胡志堅

（1.福建醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系，福州 350122；2.泉州市安溪縣醫(yī)院放療科，福建 泉州 352400）

我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，2017 年《國家癌癥中 心最新研究報告》報道，食管癌發(fā)病率為14.09/10萬，居我國腫瘤發(fā)病第五位［1］。盡管治療技術(shù)在不斷改進［2］，但患者總體預后仍然較差［3］。鋅指蛋白（zinc finger protein，ZNF）是最大的DNA結(jié)合蛋白家族，ZNF DNA結(jié)合域通常與核酸酶或其他效應蛋白融合介導表觀遺傳反應［4］，調(diào)節(jié)基因的表達，進而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究［5］發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因低表達與胃癌不良預后相關，可作為判斷腫瘤預后的標志物。然而，目前尚無ZNF568基因表達聯(lián)合DNA甲基化與食管癌預后的關聯(lián)研究。因此，本研究通過聯(lián)合分析癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫ZNF568基因表達和DNA甲基化與食管癌預后的關聯(lián)，為食管癌預后的預測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)下載與預處理

通過TCGA數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)（https：//portal.gdc.cancer.gov），下載食管癌DNA甲基化數(shù)據(jù)、基因表達數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)，使用Perl腳本進行注釋，并對注釋后的數(shù)據(jù)進行預處理。

1.2 癌細胞系百科全書（Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)下載

通過CCLE數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)（https：//portals.broadinstitute.org/ccle/），下載食管癌ZNF568基因表達和DNA甲基化數(shù)據(jù)，驗證ZNF568基因表達和DNA甲基化之間的關聯(lián)。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用R軟件中的limma包對DNA甲基化數(shù)據(jù)進行芯片歸一化處理，并對食管癌癌組織與癌旁組織進行DNA甲基化差異分析；使用edgeR包分析食管癌癌組織與癌旁組織ZNF568基因的表達情況；篩選條件為錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR ）=0.05，fold change=1。ZNF568基因表達水平與DNA甲基化的關聯(lián)分析使用Spearman 秩相關。采用 Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，通過 log-rank 檢驗進行生存曲線的比較；使用Cox回歸模型對ZNF568基因表達和DNA甲基化與食管癌患者預后的關聯(lián)進行單因素和多因素分析，計算風險比（hazard ratio，HR）和95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。建立預測Cox回歸分析模型列線圖，內(nèi)部驗證采用Bootstrap法，采用一致性指數(shù)（C指數(shù)）評價模型準確度。本研究使用R軟件（3.5.3）進行統(tǒng)計分析，顯著性檢驗為雙側(cè)檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫食管癌癌組織和癌旁組織ZNF568基因表達和DNA甲基化差異分析

采用R軟件中的limma包對186例食管癌癌組織和16例癌旁組織進行ZNF568DNA甲基化差異分析，發(fā)現(xiàn)ZNF568基因在癌組織中的甲基化水平高于癌旁組織（FDR＜0.001）；采用edgeR包對159例食管癌癌組織與10例癌旁組織進行ZNF568基因表達差異分析，發(fā)現(xiàn)ZNF568基因在癌旁組織中的表達水平高于癌組織（FDR ＜0.001）。見圖1。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中食管癌癌組織和癌旁組織ZNF568基因表達和DNA甲基化Fig.1 ZNF568 gene expression and DNA methylation in esophageal cancerous and paracancerous tissues in the Cancer Genome Atlas database

2.2 DNA甲基化與基因表達水平的關聯(lián)分析

對159例癌組織中ZNF568基因表達水平與DNA甲基化進行關聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因表達水平與DNA甲基化存在負相關（P＜0.001），見圖2。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中ZNF568基因表達水平與DNA甲基化的關聯(lián)分析Fig.2 Correlation analysis of ZNF568 gene expression level and DNA methylation in TCGA database

2.3 CCLE數(shù)據(jù)庫驗證ZNF568基因表達水平與DNA甲基化的關聯(lián)性

下載CCLE數(shù)據(jù)庫中食管癌細胞系（17種食管癌細胞株）ZNF568基因表達、DNA甲基化數(shù)據(jù)，Spearman秩相關分析發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因表達水平與DNA甲基化存在負相關（P=0.002），見圖3。

圖3 CCLE 數(shù)據(jù)庫中ZNF568基因表達水平與DNA甲基化的關聯(lián)分析Fig.3 Correlation analysis of ZNF568 gene expression level and DNA methylation in the Cancer Cell Line Encyclopedia database

2.4 聯(lián)合分析ZNF568基因表達和DNA甲基化與食管癌預后的關聯(lián)

Kaplan-Meier法繪制的生存曲線和log-rank檢驗分析發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因表達和DNA甲基化與食管癌生存無關聯(lián)（P=0.059，圖4）。調(diào)整性別、年齡、分化程度和TNM分期后，多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因表達水平和DNA甲基化聯(lián)合分析與食管癌預后存在關聯(lián)，ZNF568基因高表達、DNA低甲基化能改善食管癌預后（HR=0.70，95%CI：0.51～0.96，P=0.043），見表1。

圖4 ZNF568基因表達水平和DNA甲基化聯(lián)合分析與食管預后的生存曲線Fig.4 Kaplan-Meier overall survival curves according to combined ZNF568 gene expression and DNA methylation

表1 ZNF568基因表達水平和DNA甲基化聯(lián)合分析與食管癌預后的相關性Tab.1 Analyses of combined ZNF568 gene expression and DNA methylaiton in relation to overall survival

2.5 構(gòu)建ZNF568基因表達和DNA甲基化聯(lián)合分析的列線圖

使用多因素Cox回歸分析的變量構(gòu)建列線圖（圖5），ZNF568基因表達和DNA甲基化聯(lián)合分析能很好地預測食管癌預后，C指數(shù)為0.697（95%CI：0.543～0.851）。

圖5 ZNF568基因表達和DNA甲基化聯(lián)合分析預測食管癌總生存的列線圖Fig.5 Nomogram for overall survival according to combined ZNF568 gene expression and DNA methylation

3 討論

TCGA是一個國際項目，收集了高質(zhì)量的腫瘤和正常組織樣本，并在多個高通量平臺上進行了分子分析，收錄了各種人類腫瘤的基因組變異、mRNA表達、DNA甲基化、臨床信息等數(shù)據(jù)［6］。在大數(shù)據(jù)時代的背景下，生物信息學分析利用如TCGA數(shù)據(jù)庫等高通量數(shù)據(jù)庫，在腫瘤的全面研究中發(fā)揮了重要作用。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析食管癌DNA甲基化和基因表達的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因高表達、DNA低甲基化能改善食管癌預后，使用ZNF568基因表達和DNA甲基化聯(lián)合分析構(gòu)建的列線圖能很好地預測食管癌預后，C指數(shù)為0.697，說明ZNF568基因表達和DNA甲基化聯(lián)合分析可作為預測食管癌預后的標志物。

ZNF是最大的DNA結(jié)合蛋白家族，可作為真核生物中的轉(zhuǎn)錄因子，并通過特征性鋅指結(jié)構(gòu)域選擇性結(jié)合靶基因啟動子中的特定DNA序列［7-8］。ZNF DNA結(jié)合域通常與核酸酶或其他效應蛋白融合介導表觀遺傳反應［4］。不同腫瘤的研究［9］已經(jīng)證明宿主DNA高甲基化導致腫瘤抑制基因沉默，而低甲基化區(qū)域與癌基因的表達增加。目前，尚無ZNF568基因表達聯(lián)合DNA甲基化與食管癌預后的研究，但ZNF家族基因DNA甲基化和基因表達與腫瘤預后已有研究報道。使用TCGA數(shù)據(jù)庫，ZHANG等［10］發(fā)現(xiàn)，ZNF726基因低表達能改善結(jié)腸癌的預后（HR=0.55，95%CI：0.34～0.89），使用CCLE數(shù)據(jù)庫進一步評估結(jié)腸癌細胞中ZNF726基因表達，發(fā)現(xiàn)甲基化的調(diào)節(jié)對ZNF726基因起重要作用。此外，在肺鱗狀細胞癌的研究［11］中發(fā)現(xiàn)，ZNF454基因是肺鱗狀細胞癌預后相關的甲基化驅(qū)動基因，通過聯(lián)合分析ZNF454基因表達和DNA甲基化的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ZNF454基因低表達、DNA高甲基化能改善肺鱗狀細胞癌的預后（P＜0.05）；對肺鱗狀細胞癌ZNF454甲基化驅(qū)動基因進行通路分析，發(fā)現(xiàn)ZNF454基因主要作用的途徑為“通用轉(zhuǎn)錄”“ RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄”和“基因表達”，提示ZNF454基因表達和DNA高甲基化存在關聯(lián)。以上的研究說明ZNF家族基因甲基化與腫瘤預后存在關聯(lián)，可作為判斷腫瘤預后的標志物。

目前，僅有一篇研究報道了ZNF568基因表達與胃癌的關聯(lián)，WANG等［5］使用TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因等5個基因是胃癌的突變基因，ZNF568基因低表達與胃癌預后存在關聯(lián)（P＜0.05），ZNF568基因表達可作為預測胃癌預后的標志物。然而，目前尚無ZNF568基因表達和DNA甲基化與腫瘤預后的相關研究。本研究通過使用TCGA數(shù)據(jù)庫，聯(lián)合分析ZNF568基因表達和DNA甲基化發(fā)現(xiàn)，ZNF568基因高表達、DNA低甲基化與食管癌預后相關；構(gòu)建ZNF568基因表達和DNA甲基化聯(lián)合分析的列線圖，結(jié)果顯示，使用該基因能很好地預測食管癌的預后（C指數(shù)為0.697），說明ZNF568基因表達和DNA甲基化聯(lián)合分析可用于預測食管癌預后。與經(jīng)典遺傳學改變不同，甲基化修飾的過程動態(tài)可逆［12］，因此，抑制ZNF568DNA甲基化作用可使上調(diào)ZNF568基因重新表達，這一特性也為食管癌的臨床治療提供新的思路。

綜上所述，ZNF568基因高表達、DNA低甲基化與食管癌預后相關，檢測食管癌ZNF568基因表達水平和DNA甲基化程度有助于判斷食管癌的預后。