熊慧，戢丹菊，楊家林，劉德洪

（鄂州職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北鄂州436099）

隨著機(jī)體衰老，皮膚生理結(jié)構(gòu)出現(xiàn)功能退化現(xiàn)象，本課題組在前期研究中，提示九龍蟲具有抗衰老作用[1]，本實(shí)驗(yàn)主要研究九龍蟲對D-半乳糖衰老模型小鼠皮膚組織水分、水通道蛋白3、透明質(zhì)酸、羥脯氨酸、總膠原蛋白、Ⅲ型蛋白的影響。

1 材料與儀器

1.1 動物

清潔級KM 小鼠60 只，體重20±2g，雌雄各半，動物合格證號：42000600015619，許可證號:SCXK(鄂)2015-0018，湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供。

1.2 試劑

D-半乳糖，批號：20190523，購自上海喜潤化學(xué)工業(yè)有限公司；九龍蟲散，本院自制，用前配成混 懸 液；透 明 質(zhì) 酸 試 劑 盒 （ELISA），批 號：20200606，購自自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；羥脯氨酸試劑盒（ELISA），批號：20200613，購自自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；皮膚Ⅲ型膠原蛋白試劑盒，批號：20200712，彈性蛋白ELISA 試劑盒，批號：20200723，水通道蛋白3ELISA 試劑盒，批號：202006013，購自南京建成生物工程研究所；維生素E 膠丸，批號：20190724，購自海南養(yǎng)生堂保健品有限公司。

1.3 儀器

渡揚(yáng)DOR YANG UV759 掃描型紫外可見分光光度計(jì)，渡揚(yáng)精密儀器（上海）有限公司；便攜彈性水分油光皮膚測試儀，韓國HUNTKEY 公司；高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；9602A 酶標(biāo)儀，南京普朗醫(yī)用設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 天后，將60 只小鼠隨機(jī)分為6組：分別為九龍蟲高、中、低劑量組、維生素E 組、正常組、模型組。造模，九龍蟲高、中、低劑量組、維生素E 組和模型組每日注射半乳糖于小鼠頸背皮下，劑量為120mg/kg，一共42 天，致亞急性衰老模型；正常組每日于小鼠頸背皮下注射等量生理鹽水。給藥，造模1 周后，九龍蟲高、中、低劑量組分別給予0.040、0.020、0.010g/kg·d 九龍蟲混懸液灌胃，維生素E 組灌胃維生E15mg/kg·d，模型組及正常組給予生理鹽水15ml/kg·d 灌胃。最后一次給藥24 小時(shí)后，處死動物，立即取樣，檢測各項(xiàng)指標(biāo)：

2.2 皮膚水分檢測

取適量背部皮膚，用皮膚水分測定儀采用干燥法檢測皮膚含水量。皮膚含水百分率=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%

2.3 皮膚組織透明質(zhì)酸、羥脯氨酸、Ⅲ型膠原蛋白和膠原蛋白檢測

取背部皮膚約1g，剪碎，加入9 倍生理鹽水，勻漿，2500 r/min 離心10 min，取上清液，按試劑盒說明檢測透明質(zhì)酸、羥脯氨酸、Ⅲ型膠原蛋白和膠原蛋白含量。

2.4 皮膚組織水通道蛋白3 檢測

取背部皮膚約1cm2，剪碎，按1:9 比例加入生理鹽水，勻漿，2500r/min 離心10min，取上清液1ml，按1∶9 比例用生理鹽水再次勻漿，2500r/min 離心5min，按試劑盒說明取上清液檢測水通道蛋白3 含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用spss21.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，用T 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 對小鼠皮膚水分、水通道蛋白3 的影響

3 含量明顯低于正常組，差異有極顯著意義 （P<0.01）；而九龍蟲各劑量組和維生素E 組皮膚含水率、水通道蛋白3 明顯升高（P<0.05 或P<0.01），與模型組比較，提示九龍蟲可以明顯改善衰老小鼠皮膚水分和水通道蛋白3 含量。

表1 九龍蟲對衰老模型小鼠皮膚水分、水通道蛋白3 的影響(x±S，n=10)

3.2 對小鼠皮膚組織透明質(zhì)酸、羥脯氨酸的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組皮膚組織透明質(zhì)酸、羥脯氨酸含量明顯降低（P<0.01）），與正常組比較；與模型組比較，九龍蟲各劑量組和維生素E 組皮膚組織透明質(zhì)酸、羥脯氨酸明顯升高（P <0.05 或P<0.01）。見表2。

表2 九龍蟲對衰老模型小鼠皮膚組織透明質(zhì)酸、羥脯氨酸的影響(x±S，n=10)

3.3 對小鼠皮膚組織Ⅲ型膠原蛋白、膠原蛋白的影響

由表3 可見，與正常組比較，模型組皮膚組織Ⅲ型膠原蛋白、膠原蛋白含量明顯降低，差異有極顯著意義（P<0.01））；與模型組比較，九龍蟲各劑量組和維生素E 組Ⅲ型膠原蛋白、膠原蛋白含量明顯升高（P<0.05 或P<0.01），與對小鼠皮膚組織水分、水通道蛋白3、透明質(zhì)酸、羥脯氨酸的影響基本一致。

表3 九龍蟲對衰老模型小鼠皮膚組織Ⅲ型膠原蛋白、膠原蛋白的影響(x±S，n=10)

4 討論

衰老是一種自然規(guī)律，而衰老過程中變化最為顯著的器官之一就是皮膚，此過程中，逐漸出現(xiàn)皮膚組織缺水、表皮和真皮層變薄、皮膚膠原蛋白減少、黑色素沉積，從而使皮膚變得松弛、無光澤、并產(chǎn)生皺紋、色斑等現(xiàn)象[2]。隨著皮膚衰老，表皮層和真皮層逐漸變薄，皮膚內(nèi)水分也隨之損失，因此，隨著年齡的增長，皮膚水分含量會下降[3]，故皮膚含水量可以作為檢測皮膚衰老指標(biāo)之一；皮膚的水轉(zhuǎn)運(yùn)可影響皮膚含水量，而水轉(zhuǎn)運(yùn)是通過水通道蛋白來實(shí)現(xiàn)的，其中水通道蛋白3 對皮膚水轉(zhuǎn)運(yùn)影響最大，其可以促進(jìn)皮膚細(xì)胞的水合能力，增加皮膚含水率，從而改善皮膚干燥、萎縮、下垂等表現(xiàn)，作為皮膚水轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白，水通道蛋白3 與皮膚自然衰老密切相關(guān)，可作為抗衰老藥物的作用靶點(diǎn)[4-5]。本試驗(yàn)顯示，九龍蟲可明顯提高衰老小鼠皮膚含水量和水通道蛋白3 含量，其中九龍蟲高劑量組和中劑量組的改善效果優(yōu)于維生素E 組。

透明質(zhì)酸是一種大量存在于表皮和真皮的結(jié)構(gòu)成分，屬于細(xì)胞外基質(zhì)，是一種非常理想的皮膚保濕劑，因?yàn)槠淇梢钥刂破つw水分平衡，對皮膚組織有很強(qiáng)的保水作用，從而維持皮膚含水率，延緩皮膚衰老。人體皮膚組織透明質(zhì)酸的含量是隨著年齡的增長逐漸減少的，也是皮膚衰老的表現(xiàn)之一。因此，透明質(zhì)酸是衡量真皮層保濕能力及皮膚衰老的最佳指標(biāo)之一[6]。本試驗(yàn)顯示，九龍蟲可明顯提高衰老小鼠皮膚透明質(zhì)酸含量，結(jié)果與上述皮膚含水量和水通道蛋白3 一致。

膠原蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白，是皮膚的重要組成成分，真皮層衰老主要原因就是膠原蛋白的減少，真皮層在皮膚的中間，大部分由蛋白質(zhì)構(gòu)成，這部分蛋白質(zhì)主要由膠原蛋白和彈性纖維組成，缺少膠原蛋白就會造成真皮層萎縮，皮膚下垂長皺紋，面部衰老。在組成膠原蛋白的所有氨基酸中，其中含量最多、最穩(wěn)定、最重要的是羥脯氨酸。因此，膠原蛋白和羥脯氨酸含量的高低可以判斷出受試動物皮膚衰老的程度[7-8]。本試驗(yàn)顯示，九龍蟲可明顯提高衰老小鼠皮膚羥脯氨酸、膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白含量。

九龍蟲可以改善皮膚衰老模型小鼠皮膚皮膚含水量、水通道蛋白3、透明質(zhì)酸、羥脯氨酸、膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白含量，具有一定的體內(nèi)抗皮膚衰老作用。